可直接利用秸秆水解液发酵的丁醇生产菌种的筛选

摘要

丁醇因其特性，具有替代石油燃料的潜力，作为新一代生物能源被广泛研究，而利用资源丰富可再生的生物质发酵生产丁醇更是近年来国内外一大研究热点。但是生产丁醇的微生物不能直接利用自然界的生物质，而需要将纤维类生物质处理成可发酵糖，再进一步经微生物转化成丁醇。
　　本文首先采用单因素实验，对玉米秸秆稀酸处理的酸浓度、固液比、水解温度和时间进行了优化。玉米秸秆预处理条件为：2%稀硫酸，固液比1:8，浸泡4 h，反应温度121℃，反应时间2 h，得到的酸解液中还原糖浓度为30g/L，得糖率为21%。接着，对酸解液进行了酶解，对酶量、pH、温度和时间进行了优化，确定酶解条件为：酶加量0.075g/g干秸秆，起始pH4.8，50℃，反应48 h，得到的酶解液中还原糖浓度为57g/L，总得糖率为47%。
　　其次，对玉米秸秆水解液中的各主组分和副产物杂质进行了检测，并考察了丁醇产生菌利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、纤维二糖5种糖的能力。结果表明，丁醇产生菌对这5种糖的发酵利用率不同，其中对纤维二糖的利用率最高，为35%，而对阿拉伯糖的转化率最低，为17%。同时考察了丁醇菌株对甲酸、乙酸、糠醛、羟甲基糠醛、阿魏酸、香豆酸、丁香醛7种杂质的耐受性，这7种杂质都对丁醇发酵有不同程度的抑制，其中甲酸和阿魏酸的抑制作用最强，其浓度在0.2g/L时丁醇发酵均开始明显受到抑制，而当甲酸浓度在1g/L时和阿魏酸在2g/L时，丁醇发酵抑制率达80%。
　　最后，本文将出发菌株在含不同玉米秸秆水解液的培养基中逐级驯化，经过筛选，得到一株利用玉米秸秆水解液发酵丁醇产量提高11%的菌株1E9。以该菌株作为出发菌，采用NTG和ARTP进行两轮诱变，通过致死率曲线，确定NTG浓度为1.8 mg/mL，ARTP诱变处理时间为100s。以含玉米秸秆水解液的培养基进行平板筛选，并利用玉米秸秆水解液进行发酵筛选，最终得到菌株6A4,该菌杂质耐受性明显提高，直接利用不经任何方式脱毒的玉米秸秆水解液发酵，丁醇产量由8.46 g/L提高到13.43 g/L，提高了58%，总溶剂由12.12 g/L提高到18.55 g/L，提高了53%，发酵溶剂转化率由21%提高到33%，达到出发菌利用纯葡萄糖发酵丁醇的转化率水平，将该菌株连续传代5次分别进行发酵，产量稳定，说明该菌株遗传稳定。

目录

声明

1 绪论

1.1丁醇发酵

1.2 木质纤维素原料

1.3 木质纤维素水解液发酵产丁醇

1.4 本论文的研究内容及意义

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 分析方法

3 玉米秸秆水解液的制备

3.1葡萄糖测定标准曲线的绘制：

3.2 玉米秸秆稀酸水解条件优化

3.3 玉米秸秆稀酸水解后酶解条件优化

3.4 小结

4 水解液中各成分对丁醇发酵的影响

4.1 水解液中糖及副产物的测定

4.2 丁醇菌株利用水解液中不同糖发酵丁醇的能力

4.3 水解杂质对丁醇发酵的影响

4.4 小结

5菌种驯化与诱变筛选

5.1 96深孔板发酵初筛可行性确定

5.2 菌种驯化

5.3 诱变筛选

5.4 小结

6 结论与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间的学术成果