东海近海三疣梭子蟹种群遗传结构的初步研究

摘要

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种重要的海洋经济蟹类，分类上隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、梭子蟹科，广泛分布在日本、韩国、中国以及马来西亚等水域。由于过度捕捞，东海海区三疣梭子蟹资源出现衰退，资源年间波动明显。近年来，我国沿海各地广泛开展了三疣梭子蟹的人工养殖活动，在取得了经济效益的同时，也增加了个体间的基因交流，从而产生了种质资源保护、管理等方面的问题。开展三疣梭子蟹种群的遗传多样性评价及种群遗传结构的研究，对了解三疣梭子蟹种质资源现状具有现实的指导意义。 本文采集了我国东海近海三疣梭子蟹6个野生群体(长江口、嵊泗群岛、舟山群岛、洞头群岛、定海湾、泉州湾)共213个样品，对其线粒体DNA16S rRNA 和细胞色素氧化酶亚基I(Cytochrome Oxidase subunit I，CO I)基因片段进行测序，以研究东海近海三疣梭子蟹的遗传多样性水平和种群遗传结构，以期为三疣梭子蟹种质资源的有效管理、利用和保护提供一定的理论依据。 采用酚氯仿法提取基因组DNA，根据Genbank中三疣梭子蟹mtDNA全基因组序列设计两对引物，分别扩增mtDNA 16S rRNA和CO I基因片段序列。扩增产物经纯化回收和T载体克隆，进行序列测定。用Clustal W软件对测序结果进行序列比对，运用MEGA软件2.1版本统计每个序列片段的碱基组成和序列变异情况，并用邻接法(neighbor-joining，NJ)根据Kimura双参数遗传距离即K2-P距离构建系统发育树进行聚类分析。种群遗传多样性的分析采用DnaSP软件3.51版本，其中包括对单倍型多样性(h)和核苷酸多样性(p)两个遗传参数的计算(Nei 1987)。应用DnaSP软件进行中性测验，主要是对Tajima's D，Fu's Fs等参数进行分析，以此指示种群历史的稳定性或种群增长情况。应用ARLEQUIN软件分子变异分析法来分析种群间遗传结构状况。FST值及其相应p值(10,000次排列测验)用于表明种群间的分化程度。基因流的计算，按照Nem=1/(4FST)-1/4公式而得。 通过对213个三疣梭子蟹个体的线粒体DNA 16S rRNA基因片段测序结果进行分析，获得长度为991bp的基因片段，检测出25个单倍型和22个变异位点。1个单倍型为6个群体所共有，除长江口群体外，其他各群体均有自己特有的单倍型，各个单倍型所拥有的个体样本数从1-122不等。6个群体的核苷酸多样性范围是0.00034-0.00177，平均值为0.00104。6个群体的单倍型多样性范围为0.322±0.097-0.823±0.050,平均值为0.664±0.037。长江口与定海湾群体间的遗传分化指数最大，为0.17166(P＜0.01)，呈极显著差异；泉州湾与定海湾群体间的基因流为最大，为9.57，长江口与定海湾群体间的基因流最小，为1.21。通过对213个三疣梭子蟹个体的线粒体DNA CO I基因片段测序结果进行分析，获得长度为78Top的基因片段，检测出27个单倍型和21个变异位点。1个单倍型为6个群体所共有，各个群体都具有各自特有的单倍型，各个单倍型所拥有的个体样本数从1.92不等。6个群体的核苷酸多样性范围是0.00158-0.00356,平均值为0.00241。6个群体的单倍型多样性范围为0.582-0.847,平均值为0.787±0.026。嵊泗群岛与洞头群岛群体间的遗传分化指数最大，为0.10134(P＜0.01)，有极显著差异；长江口与嵊泗群岛群体间的基因流为最大，为160.00，嵊泗群岛与洞头群岛群体间的基因流最小，为2.22。 综合mtDNA 16S rRNA和CO I两个分子遗传标记的分析结果表明：东海近海三疣梭子蟹种群存在着明显的种群分化，福建近海海域的三疣梭子蟹群体(泉州湾和定海湾)遗传多样性水平要比浙江近海海域的三疣梭子蟹群体(嵊泗群岛、舟山群岛和洞头群岛)相对较高，而长江口群体为最低。邻接法构建的系统发育树显示，单倍型散布在不同的地方种群中，呈现出混杂的分布格局。Taiima'D中性检验和Fu's Fs分析结果均揭示东海海区三疣梭子蟹历史上曾经历了一个种群数量扩张阶段。 为了能更客观地揭示东海三疣梭子蟹的遗传多样性水平与种群遗传结构，在今后的实验中，要进行多年连续采样和多样点采样，增加三疣梭子蟹繁殖与非繁殖季节的对比采样，以此获得更可靠的实验结果。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章保护遗传学基本原理

1.1保护遗传学概述

1.2分子遗传标记

1.2.1线粒体DNA的序列多态性

1.2.2 RAPD技术

1.2.3 RFLP技术

1.2.4 AFLP遗传标记

1.2.5微卫星DNA分子标记

第二章三疣梭子蟹研究概述

2.1三疣梭子蟹资源状况

2.1.1分类与分布

2.1.2生物学特性

2.1.3资源开发利用状况

2.2国内外研究现状

2.2.1资源分布相关研究

2.2.2生物学相关研究

2.2.3养殖技术相关的研究

2.2.4分子生物学相关的研究

2.3研究技术路线、目的及意义

2.3.1研究技术路线

2.3.2研究目的与意义

第三章材料与方法

3.1材料

3.1.1实验样品

3.1.2实验试剂

3.1.3实验仪器

3.2实验方法

3.2.1基因组DNA提取

3.2.2电泳检测

3.2.3 PCR扩增

3.2.4基因克隆

3.2.5序列测定

3.2.6序列分析

第四章实验结果

4.1 16S rRNA的实验结果

4.1.1序列分析

4.1.2聚类分析(NJ tree)

4.1.3遗传多样性评价

4.1.4遗传结构分析

4.1.5中性检验

4.2 CO I的结果

4.2.1序列分析

4.2.2聚类分析(NJ tree)

4.2.3遗传多样性评价

4.2.4遗传结构分析

4.2.5中性检验

第五章讨论与结论

5.1遗传多样性

5.2群体遗传结构

5.3保护建议

5.4小结

5.5本研究有待改进的地方

参考文献

附录

致谢