双酚A对鲫鱼（Carassius auratus）肝脏生殖相关基因表达和血清性激素水平的影响

摘要

内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals，EDCs)是指干扰生物体正常的内分泌机能，并影响生物体或其后代发育、繁殖和行为的外源性化学物质，由于它往往具有类雌激素作用，故又称为环境雌激素(ecoestrogen)。EDCs对人类和野生生物的有害影响引起了许多国际组织和世界各国政府及公众的关注，成为本世纪生命科学和环境科学的重大议题之一。 双酚A(bisphenol-A，BPA)是生产聚碳酸树脂和环氧树脂的重要原料。由于BPA在食品包装材料上的广泛使用，它的安全性问题受到极大关注。研究表明BPA是一种内分泌干扰物。水域环境是EDCs最后的归宿点，鱼类和其它水生动物已受到EDCs的损伤是不争的事实，但对EDCs在水生动物体内的作用生理过程远未认识清楚。本论文研究了以双酚A为代表的内分泌干扰物对典型淡水鱼类鲫鱼的内分泌干扰作用。主要研究内容如下： 1.BPA对雌鲫肝脏VTG、ERa和CYP1A1 mRNA表达的影响以不同浓度的BPA(质量分数分别为1mg／kg，50mg／kg，100mg／kg(注射剂量／鱼体重))对雌鲫进行腹腔注射，分别于24h和48h检测肝脏中的卵黄蛋白原(vitellogenin，VTG)mRNA、a型雌激素受体(estrogen receptor，ERa)mRNA和细胞色素CYP1A1(cytochrome P4501A1，CYP1A1)mRNA表达水平的变化情况。旨在探讨BPA对鲫鱼的内分泌干扰过程。 结果发现：1mg/kg处理组VTG mRNA水平在48h内没有明显变化；50mg/kg与100mg／kg处理组VTG mRNA水平在24h内没有明显差异，至48h显著上升。说明。BPA具有雌激素效应，但对雌鲫VTG的诱导需要较高的剂量以及较长的作用时间。1mg／kg和50mg／kg BPA处理组ERa mRNA水平与对照组相比在48h内均没有明显变化；100mg／kg BPA处理组ERa mRNA水平在注射后24h显著上调(P<0.05)，48h时仍维持较高水平。结果表明雌鲫肝脏ERa mRNA水平只有在最高浓度组(100mg／kg)中显著上升。另外，1mg/kg处理组CYP1A1：mRNA水平在24h显著上升(P<0.05)，48h时恢复至正常水平；50mg／kg和100mg／kg BPA处理组CYP1A1mRNA水平在24h和48h均没有明显变化。肝脏ERa mRNA只有在最高浓度组(100mg／kg)中被显著诱导，而CYP1A1 mRNA水平仅在最低浓度组(1mg／kg)中短期内显著上升。由于ERa mRNA的表达受ER介导，而CYP1A1的表达受芳烃受体(AhR)介导，因此推测BPA在高、低浓度下其作用机制可能不同，低浓度时通过诱导CYP1A1 mRNA的表达从而提高对内源性和外源性化合物的代谢，高浓度时可通过ERa途径实现雌激素效应效应。另外，值得注意的是，BPA寸雌鲫VTG的诱导需要较高的剂量以及较长的作用时间，而CYP1A1 mRNA恰恰相反，其水平只有在最低浓度的BPA作用下短期内显著上升。由于CYP1A1对性类固醇激素雌二醇(E2)具有羟化作用能促进E2代谢，而E2在鱼类VTG水平中起着重要的调控作用。因此，为了更好地阐明BPA的内分泌干扰作用，有必要对BPA与鱼类性固醇激素水平的关系进行研究。 2.双酚A对鲫鱼血清性类固醇激素水平的影响以不同浓度的BPA(质量分数分别为1mg／kg，50mg／kg，100mg/kg(注射剂量／鱼体重))对鲫鱼进行腹腔注射，分别于24h和48h检测雌、雄鲫鱼血清雌二醇(17β-eatradiol，E2)和睾酮(testosterone，T)水平的变化。 结果显示：1mg／kg BPA处理24h后，雌鲫血清E2浓度有显著下降，而50mg／kg和100mg／kg BPA处理组E2浓度均显著增加，表现为低浓度BPA暴露导致血清E2水平下降、高浓度BPA导致E2水平上调。这种现象可能是BPA高低浓度下对E2代谓}的影响不同造成的。由于E2下降的同时伴随着CYP1A1 mRNA水平的上升，而CYP1A1能促进E2代谢从而降低E2水平，从而为这种推测提供了依据。雌鲫血清T水平在整个实验过程中没有出现显著变化。可见，雌鲫血清E2对BPA的敏感性比T强。而对于雄性鲫鱼，BPA的雌激素效应表现为诱导血浆E2水平上升，并使T水平下降，但BPA各处理组的性激素水平波动较大，不同浓度处理组之间变化趋势不一致。以上结果表明BPA对雌、雄鲫鱼都有内分泌干扰作用，并且BPA对鱼类性类固醇激素水平的影响可能跟雌雄性别有关。 结合以上两个方面的研究可见，BPA能诱导雌鲫肝脏VTG mRNA水平、ERamRNA水平和血清E2水平显著上升，表现了BPA的雌激素效应。1mg／kg BPA处理组中，血清E2水平出现短暂下降，而肝脏ERa mRNA水平和VTG mRNA水平没有明显变化。此浓度下，BPA可能模拟E2与ERa结合从而维持了ER和VTG的转录水平。另外，E2下降的同时伴随着CYP1A1 mRNA水平的显著上升，由于CYP1A1能促进E2代谢从而导致E2水平下降，并且CYP1A1的诱导是通过AhR途径实现的，因此，在1mg／kg浓度下BPA可能通过AhR途径对雌鲫产生内分泌干扰作用。50mg／kg BPA处理后，血清E2水平和肝脏VTG mRNA水平在48h时均显著上升，而此时肝脏ERa mRNA水平没有明显变化，说明此时肝脏中ERa水平足以与较高浓度的E2或BPA结合促进VTG的表达，表明肝脏ERa对BPA的敏感性不如血清E2和肝脏VTG强。100mg／kgBPA处理后，肝脏ERa mRNA水平和VTG mRNA水平及血清E2水平在48h均显著上升，表明此浓度下BPA的雌激素效应比50mg／kg和1mg／kg大。比较雌鲫中各生理指标对BPA的敏感性可见，肝脏ERa mRNA只有在100mg／kg BPA处理组中显著增加，CYP1A1 mRNA只有在1mg／kg BPA处理组中显著上升，VTG mRNA和血清E2在50mg／kg和100mg／kg BPA处理组中均被显著诱导，但VTG mRNA水平的上升较为滞后，而雌鲫血清T水平在整个实验过程中没有明显变化。本试验中，E2表现出比肝脏ERa、VTG和CYP1A1对BPA更高的敏感性，而雌鲫血清T对BPA的敏感性最弱。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章引言

1.1内分泌干扰物概述

1.1.1内分泌干扰物的定义

1.1.2内分泌干扰物的种类

1.1.3内分泌干扰物的危害

1.2双酚A的研究现状

1.2.1双酚A的化学结构及性质

1.2.2双酚A的毒性作用

1.2.3双酚A对水生生物的危害

1.3内分泌干扰物的研究手段

1.3.1配体-受体结合法

1.3.2子宫增重法

1.3.3酶联免疫吸附试验法

1.3.4分子生物学方法

1.3.5鱼类生物标志物在内分泌干扰物研究中的应用

1.4内分泌干扰物的作用机制

1.4.1受体介导途径

1.4.2非受体介导途径

1.5本论文研究的意义

第二章双酚A对雌鲫肝脏VTG、ERa和CYP1A1 mRNA表达的影响

2.1材料和方法

2.1.1仪器与药品

2.1.2实验动物及处理

2.1.3引物设计

2.1.4总RNA提取和纯化

2.1.5 cDNA第一链合成

2.1.6 RT-PCR及产物回收

2.1.7实时荧光定量标准曲线的制备

2.1.8 Real-time RT-PCR定量分析

2.1.9数据分析

2.2结果和分析

2.2.1总RNA完整性和纯度

2.2.2检测系统的可靠性和稳定性

2.2.3 BPA对VTG mRNA表达的影响

2.3.4 BPA对ERa mRNA表达的影响

2.3.5 BPA对CYP1A mRNA表达的影响

2.3讨论

2.3.1 BPA对VTG mRNA表达的影响

2.3.2 BPA对ERa mRNA表达的影响

2.3.3 BPA对CYP1A1 mRNA表达的影响

第三章双酚A对鲫鱼血清性激素水平的影响

3.1材料和方法

3.1.1药品与仪器

3.1.2动物及处理

3.1.3血清提取及性激素水平测定

3.1.4数据处理与统计

3.2结果

3.2.1 BPA对雌鲫血清E2水平的影响

3.2.2 BPA对雌鲫血清T水平的影响

3.2.3 BPA对雄鲫血清E2水平的影响

3.2.4 BPA对雄鲫血清T水平的影响

3.3讨论

第四章小结

参考文献

致谢