长石莼(缘管浒苔)rbcL全长基因克隆与序列分析及主要漂浮种ITS及rbcL序列分析

摘要

本文主要对长石莼（缘管浒苔）（Ulva linza）光合作用第一个关键酶核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Ribulose1，5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase，E．C．4．1．1．39，简称Rubisco）大亚基全长基因（rbcL）及其侧向调控序列进行了克隆和序列分析，进而对该基因在不同光照条件下的表达差异进行了研究，为进一步研究浒苔快速生长的分子机制奠定一定基础。同时利用rbcL序列结合ITS序列对浒苔系统进化进行研究。 首先应用RT-PCR技术结合RACE（cDNA末端快速扩增技术），获得缘管浒苔rbcL基因全长cDNA序列。序列全长1472bp，其中包括1425bp的编码区序列及47bp的前导序列（NCBI登录号：DQ813496），编码474个氨基酸。缘管浒苔rbcL基因5’端的前导序列远比高等植物的短且不含有高等植物rbcL前导序列中普遍存在的SD序列（GGAGG）。此外，缘管浒苔rbcL基因前导序列在翻译起始位点ATG前为一段富含A/T的序列。根据推导的氨基酸序列预测了缘管浒苔Rubisco酶大亚基的二级、三级结构。其二级结构，包括199个α-螺旋、52处延伸直带及210处自由卷曲；预测的三级结构与二级结构有一定的相似性，推测与其功能域密切相关。 利用基因组步移技术，获得缘管浒苔rbcL基因DNA序列。序列全长2124bp（NCBI登录号：DQ813497），其中编码区序列长1425bp，为单外显子基因；5’非翻译区序列长225bp，转录起始位点为位于翻译起始密码子ATG上游第47个核苷酸G，在距离转录起始位点-9bp～-48bp的范围内有推测的类似原核生物的启动予序列（-10区：TAAAAT、-35区：TTGAAA）；3’非翻译区序列长474bp，在距离转译终止密码子TAA下游54bp～98bp处有一段较长的回文序列，可形成一个22bp的茎结构。密码子偏好性分析结果表明，长石莼（缘管浒苔）rbcL基因偏向使用第三位核苷酸碱基为A和T的密码子。 Rubisco为光合作用第一关键酶，其表达与活性直接与植物光合速率、生长速度及产量具有重要关系。利用实时定量PCR技术，通过相对定量法对缘管浒苔在不同光照条件处理下rbcL基因表达情况进行了研究。研究表明：缘管浒苔rbcL基因的表达受光的调控，且在低光强下基因的表达丰度高于在高光强下的表达丰度。 2008年6-7月在青岛近海海域再次发生大量浒苔漂浮现象，并且江苏连云港、如东近海海域也发生了浒苔漂浮现象。从三地采集的浒苔样品基因组DNA获得rbcL序列及ITS序列，进行序列分析，并与采自上海金山海区的浒苔样品进行了比较。序列分析结果表明，青岛、连云港、如东海域主要漂浮种类是同一种浒苔。利用rbcL基因对浒苔样品系统发育分析，与ITS基因建树结果一致，青岛、连云港、如东海域的浒苔样本中绝大多数样本聚在一起，并且与U．linza，U．prolifera和U．procera亲缘关系较近，而与采自上海金山海区的浒苔样品（W01，W02，W04）的亲缘关系较远。提示2008年青岛出现的漂浮浒苔与连云港、如东近海海域的漂浮浒苔存在一致性。

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引言

第一章 缘管浒苔rbcL全长cDNA克隆与序列分析

1 材料与方法

1.1 材料与藻体的培养

1.2 缘管浒苔总RNA的提取

1.3 缘管浒苔rbcL基因cDNA部分序列克隆

1.4 缘管浒苔rbcL基因5’端cDNA序列克隆

1.5 缘管浒苔rbcL基因3’端cDNA序列克隆

1.6 序列生物信息分析与蛋白质结构预测

2 结果

2.1 缘管浒苔总RNA提取与电泳检测

2.2 缘管浒苔rbcL基因cDNA部分序列克隆与分析

2.3 缘管浒苔rbcL基因5’端cDNA序列克隆与分析

2.4 缘管浒苔rbcL基因3’端cDNA序列克隆与分析

2.5 缘管浒苔rbcL基因全长cDNA序列拼接与蛋白质序列推断

2.6 同源性分析与进化树构建

2.7 氨基酸序列分析与蛋白质结构预测

3 讨论

第二章 缘管浒苔rbcL基因分离及其侧向调控序列的研究

1 材料与方法

1.1 材料与藻体培养

1.2 缘管浒苔基因组DNA与总RNA的提取

1.3 缘管浒苔rbcL部分DNA序列与cDNA序列的克隆

1.4 缘管浒苔rbcL 5’端上游序列与3’端下游序列的克隆

1.5 全长基因的获得与密码子偏好性分析

2 结果

2.1 缘管浒苔基因组DNA与总RNA提取

2.2 缘管浒苔rbcL大片段DNA序列及cDNA序列克隆与分析

2.3 缘管浒苔rbcL 5’端上游序列及rbcL 3’端下游序列的克隆与分析

2.4 缘管浒苔rbcL全长基因序列的分析与蛋白质序列的推断

2.5 密码子偏好性分析

3 讨论

第三章 缘管浒苔rbcL基因在不同光照条件下的表达差异研究

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 缘管浒苔总RNA的提取

1.3 第一链cDNA的合成及PCR测试

1.4 Real—Time PCR

2 结果与分析

2.1 缘管浒苔总RNA的提取及检测

2.2 第一链cDNA的合成及PCR测试结果

2.3 不同光照条件处理下缘管浒苔rbcL的表达差异

3 讨论

第四章 我国近海海域绿潮浒苔ITS及rbcL序列分析

1 材料与方法

1.1 样品采集

1.2 基因组总DNA的提取与ITS及rbcL序列的获得

1.3 序列相似性分析和系统发育研究

2 结果与分析

2.1 主要漂浮种类rbcL序列分析

2.2 主要漂浮种类ITS全长序列分析

2.3 主要漂浮种类ITS全长序列和rbcL序列系统发育树分析

3 讨论

结论

参考文献

致谢