基于温度驯化的淡水鱼骨骼肌肌球蛋白功能性质的变化及分子机理的研究

摘要

肌球蛋白约占鱼肌原纤维蛋白质的50％以上，它主要决定了鱼肌肉蛋白质的功能和性质，进而影响鱼肌肉蛋白质的加工适性。肌球蛋白分子由两条重链亚基和四条轻链亚基组成。肌球蛋白重链的球状头部具有ATPase活性和与肌动蛋白结合的能力；纤维状的杆状部分在生理性离子强度下具有形成丝状的能力，并与鱼肌肉蛋白质的凝胶形成能力有关。本文选取广温性四大家鱼中的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)作为研究对象，第一部分的研究工作主要考察了热驯化条件下，草鱼骨骼肌肌球蛋白热稳定性和动态粘弹性的变化规律。第二部分的研究工作，通过RT-PCR法考察了已知的三种草鱼肌球蛋白重链同工型基因在不同热驯化阶段草鱼骨骼肌中的表达模式，旨在阐明草鱼肌肉蛋白质功能性质伴随环境温度发生变化的分子机理。第三部分的研究工作主要通过RT-PCR法和3'-RACE法从冬季和夏季鲢鱼的骨骼肌中分离到两种肌球蛋白重链同工型基因，并通过Long-PCR法对它们的轻酶解肌球蛋白的部分编码序列进行了cDNA克隆及氨基酸序列的推断和解析。
　　 一.基于热驯化的草鱼骨骼肌肌球蛋白热稳定性和动态粘弹性的变化
　　 对在30℃热驯化条件下驯化不同时间的草鱼骨骼肌肌球蛋白进行提取和纯化，通过SDS-PAGE电泳证实提取的肌球蛋白具有较高的纯度。对在30℃热驯化温度下驯化不同时间的草鱼肌球蛋白在40℃的热变性温度下的变性速率常数KD进行了测定，证明肌球蛋白的热变性符合一级变性速率方程；研究结果显示，草鱼肌球蛋白的热稳定性明显随驯化时间的延长而升高，热驯化77天的草鱼肌球蛋白的热稳定性为未经驯化草鱼热稳定性的近33倍。
　　 通过差示扫描量热仪(DSC)对未驯化和30℃驯化31天的草鱼的热稳定性进行了测定和比较，研究结果表明，草鱼肌球蛋白的热稳定性受热驯化时间变化的影响，未驯化和30℃热驯化31天的草鱼肌球蛋白的热转化温度(Tm)分别为37和43.6℃，表明两者肌球蛋白的结构可能不同，进而证明了30℃热驯化草鱼肌球蛋白的热稳定性优于未经热驯化的草鱼肌球蛋白。
　　 此外，通过测定不同热驯化阶段草鱼肌球蛋白动态黏弹性的变化，在流变学理论上证明淡水鱼肌球蛋白的凝胶特性与热驯化之间的关系。研究结果表明，草鱼肌球蛋白的凝胶形成特性受热驯化时间长短的影响；未经热驯化的草鱼肌球蛋白形成凝胶的温度低于热驯化49、63、77天的草鱼，表明肌球蛋白的热稳定性越差，其形成凝胶的起始温度亦越低。
　　 二.三种草鱼肌球蛋白重链同工型基因在不同热驯化阶段草鱼骨骼肌中的表达模式
　　 通过RT-PCR法考察了草鱼三种肌球蛋白重链同工型基因在不同热驯化阶段草鱼骨骼肌中的表达模式，结果表明：热驯化0-31天的草鱼肌肉中主要表达低温型(gc-10)的肌球蛋白重链同工型基因，而中间型(gcI)和高温型(gc-30)的肌球蛋白重链同工型基因在热驯化19-77天的草鱼肌肉中都有表达，且高温型(gc-30)表达量相对要多。据此，可以认为热驯化不同时间的草鱼在肌球蛋白的性质和功能上展现的差异可能与肌球蛋白重链同工型基因的差异表达有关。
　　 三.鲢鱼部分轻酶解肌球蛋白同工型基因的cDNA克隆
　　 通过RT-PCR法和3'-RACE法从冬季和夏季鲢鱼的骨骼肌中分离到两种肌球蛋白重链同工型基因，分别命名为低温型(SC-W)和高温型(SC-S)。两种同工型基因的cDNA序列包含了部分3'-翻译区和全部3'-非翻译区，编码了鲢鱼轻酶解肌球蛋白(light meromyosin，LMM)羧基端的一部分氨基酸序列。在终止密码子的上游和下游区域，两种同工型基因之间在核苷酸序列上显示了明显的差异，其序列同源性为79.5％，推断的氨基酸序列的同源性为88.1％；根据与草鱼和鲤鱼相关同工型氨基酸序列的比对结果，发现在15个氨基酸残基位点上鲢鱼低温型(sc-w)与草鱼10℃型(gc10)一致，但两者显示了与其它同工型不同的特有变异，并且其中的11个位点属高度保守性残基。这些结果似乎表明了基于低温驯化的淡水鱼表达的肌球蛋白重链同工型必须在它们的初级结构上发生某些氨基酸残基的变异才能有助于其适应低温的栖息环境，在蛋白质水平上则展现出完全不同于高温栖息鱼类的肌球蛋白功能和性质。另一方面，通过构建分子系统树，证明了来自相似栖息环境温度的鱼的肌球蛋白重链之间具有更近的基因距离，进一步证明了环境温度对广温性淡水鱼肌球蛋白重链的基因歧化和功能进化的影响。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章引 言

1.1我国淡水鱼资源及其加工现状

1.2淡水鱼栖息环境的特点及其对肌肉蛋白质功能性质的影响

1.3鱼类蛋白质的特点

1.3.1鱼类蛋白质的组成

1.3.2肌球蛋白概述

1.3.3肌球蛋白的种类

1.3.4肌球蛋白分子的结构特点及功能性质

1.4淡水鱼肌球蛋白国内外研究现状

1.4.1淡水鱼肌球蛋白热稳定性的变化与环境温度之间的关系

1.4.2肌球蛋白在鱼糜凝胶过程中的作用

1.4.3基于热分析的肌球蛋白热稳定性及其结构的研究

1.4.4基于流变学性质测定的肌球蛋白黏弹性变化研究

1.4.5淡水鱼肌球蛋白多基因家族的研究

1.5本研究的目的和意义

第二章草鱼在热驯化过程中肌球蛋白Ca2+-ATPase变性速率常数的变化

2.1实验材料和仪器设备

2.1.1实验鱼

2.1.2实验试剂

2.1.3实验仪器和设备

2.2实验方法

2.2.1肌球蛋白的提取和纯化

2.2.2肌球蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2.3蛋白质标准曲线的绘制

2.2.4磷标准曲线的制作

2.2.5肌球蛋白Ca2+-ATPase活性的测定

2.2.6肌球蛋白Ca2+-ATPase变性速率常数KD的测定

2.3实验结果

2.3.1肌球蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

2.3.2 30℃热驯化过程中草鱼肌球蛋白Ca2+-ATPase变性速率常数的变化

2.4本章小结

第三章30℃热驯化过程中草鱼肌球蛋白结构的变化

3.1实验材料及仪器设备

3.1.1实验鱼

3.1.2主要仪器设备

3.2实验方法

3.2.1肌球蛋白的提取

3.2.2肌球蛋白的DSC分析

3.3实验结果

3.4本章小结

第四章30℃热驯化过程中草鱼肌球蛋白凝胶化特性的变化

4.1实验材料和仪器设备

4.1.1实验鱼

4.1.2仪器设备

4.2实验方法

4.3实验结果

4.4本章小结

第五章三种草鱼肌球蛋白重链同工型基因在30℃热驯化不同阶段的草鱼肌肉中的表达

5.1实验材料和仪器设备

5.1.1主要试剂

5.1.2主要仪器设备

5.2主要试剂的配制

5.3实验方法

5.3.1总RNA的提取

5.3.2第一股cDNA的合成

5.3.3琼脂糖凝胶电泳

5.3.4试剂盒割胶纯化DNA

5.3.5 RT-PCR考察三种草鱼肌球蛋白重链同工型基因在不同热驯化阶段草鱼肌肉中的表达

5.4实验结果与讨论

5.4.1不同热驯化阶段的草鱼骨骼肌总RNA的电泳检测结果

5.4.2三种同工型基因在不同热驯化阶段的草鱼肌肉中的表达模式

5.5本章小结

第六章鲢鱼骨骼肌部分轻酶解肌球蛋白基因的cDNA克隆

6.1实验材料

6.1.1实验鱼

6.1.2仪器设备

6.1.3分子生物学试剂

6.2主要试剂的配制

6.3实验方法

6.3.1总RNA提取和第一股cDNA合成

6.3.2感受态细胞的制备

6.3.3连接反应

6.3.4重组质粒的转化

6.3.5蓝白斑筛选和PCR快速鉴定重组菌落

6.3.6轻酶解肌球蛋白基因的PCR扩增

6.3.7 DNA测序

6.3.8序列分析

6.3.9氨基酸的亲水性分析和分子系统树的构建

6.4结果与讨论

6.4.1冬夏季鲢鱼骨骼肌总RNA的电泳检测结果

6.4.2 Long-PCR法对编码两种肌球蛋白重链同工型的全长cDNA扩增结果

6.4.4插入检验鉴定阳性克隆

6.4.5鲢鱼部分轻酶解肌球蛋白基因的核苷酸序列比较

6.4.6鲢鱼部分轻酶解肌球蛋白的氨基酸组成分析

6.4.7分子系统树分析

6.5本章小结

第七章结论与展望

7.1研究结论

7.2研究展望

参考文献

致谢