中国近海十三种石首鱼类的分子系统进化分析

摘要

石首鱼类一直是我国重要的经济鱼类。石首鱼科鱼类种类繁多，形态相似，难以确定种属界限，一些种类的归属尚未确定。本研究首次应用核内重组激活基因RAG-1结合线粒体16SrRNA作为分子标记分析了中国沿海9属13个种（小黄鱼，大黄鱼，棘头梅童鱼，黄姑鱼，娩鱼，半花黄姑鱼，大头白姑鱼，银姑鱼，银牙鱼或，尖头黄鳍牙鱼或，勒氏石首鱼，皮氏叫姑鱼，鳞鳍叫姑鱼）的石首鱼序列，旨在进一步阐明石首鱼类的系统进化关系提供了分子依据，为中国石首鱼的种、属和亚科的划分提供新的证据，并就各种基因在研究该科鱼类系统进化研究的应用潜力做出剖析。
　　 (1)本文获得了中国沿海石首鱼科9属13个种合计48个线粒体16SrRNA基因片段，序列长约484bp，共检测到28个单倍型，170个变异位点。结合来自GenBank的5种石首鱼科鱼类的相应片段序列通过模式验证后构建最大似然进化树。根据所得分子生物学数据并结合已知形态学理论，分析得出如下结果：银牙鱼或和红牙鱼或同属于一个亚科，而尖头黄鳍牙鱼或不属于牙鱼或亚科，并推测尖头黄鳍牙鱼或可能属于拟牙鱼或属或者黄唇鱼亚科；叫姑鱼亚科和石首鱼亚科是石首鱼亚科中较早分化的种类；黄姑鱼属有可能不属于白姑鱼亚科，而可能归于一个新的亚科。
　　 (2)基于核基因RAG-1序列分析方法：用DNASTAR软件包和MEGA4.0软件进行所测序列和其他石首鱼类的同源片段序列的编辑、排序并去掉两端少许测序不稳定序列后进行比对。利用Mega4软件中“Statistics”程序对所得序列的碱基组成和核苷酸位点的替换数进行统计。采用Kimura双参数模型计算遗传距离，引用同科的攀鲈(Anabas testudineus)同源序列进行比较，分别采用NJ法(Neighbor-joining)、以及最大似然法(Maximum Likehood)等不同的建树方法对序列数据进行分析，比较不同建树方法得到结果的相似和差异。其中，ML法采用TREEFINDER进行分析。。采用MODELTEST软件确定序列最适合的进化模式。基于等级似然比检验(hierarchical likelihood ratio tests, LRTs)和标准的AIC方法从56种不同的核苷酸进化模型中判断出所要采用的模型。NJ法使用MEGA进行系统重建Bootstrap置信值估算重复次数1000次。
　　 本实验共获得48个线粒体16SrRNA基因片段，序列长约484bp，共检测到28个单倍型，170个变异位点。结合来自GenBank的5种石首鱼科鱼类的相应片段序列通过模式验证后构建最大似然进化树；测得的51条RAG-1基因经序列比对后共有位点1498个，其中230个变异位点，单倍型数量39个。系统发育树以较高的置信度分为明显的两个类群：其中叫姑鱼亚科，石首鱼亚科，白姑鱼亚科和牙鱼或亚科聚为一大支；小黄鱼、棘头梅章鱼、大黄鱼和鮸鱼组成的黄鱼亚科形成一个单系群。
　　 根据所得分子生物学数据并结合已知形态学理论，综合分析两种分子标记所得的结果，总结如下：银牙鱼或和红牙鱼或应归于一个属，但分别基于线粒体16SrRNA序列和RAG-1序列分析所得关于牙鱼或亚科的分属也存在不一致现象，需要选择进化速率更为适中的基因标记来进一步确定牙鱼或亚科的分属问题；叫姑鱼亚科和石首鱼亚科与其他石首鱼类存在明显差异，是石首鱼亚科中较早分化的种类；黄姑鱼较白姑鱼较为原始，白姑鱼亚科的分属问题有待进一步考证；同时从分子水平上再现了黄鱼亚科在石首鱼科系统发育中作为最新演化种类的进化地位。本文的研究结果为进一步阐明石首鱼类的系统进化关系提供了分子依据。

目录

文摘

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第一章 引言

1. 研究背景

2 石首鱼的形态学特征

3 石首鱼科的分类简史

4 分子系统学研究概况

4.1 系统发育学概况

4.2 分析系统树

4.3 分子系统树的构建方法

5 基于线粒体基因的序列分析方法

5.1 线粒体基因序列分析的意义

5.2 动物线粒体基因结构概况

5.3 基于线粒体基因标记的研究概况

5.4 石首鱼类线粒体基因标记的研究概况

5.5 线粒体基因标记的使用局限性

6 基于核基因的序列分析方法

6.1 引入核基因标记的必要性

6.2 核基因标记的研究现状

6.3 重组激活基因

7. 本论文所要解决的问题

第二章 基于16SrRNA部分序列探讨中国近海十三种石首鱼类的分子系统进化关系

1. 材料

1.1 实验所需试剂与仪器

1.2 实验样本及来源

2 实验方法

2.1 DNA提取

2.2 PCR扩增

2.3 PCR扩增结果检测和记录

2.4 DNA序列测定

2.5 数据分析

3. 结果

3.1 基因组DNA提取结果

3.2 序列及其变异

3.3 碱基组成与遗传距离

3.4 基于16S的系统发育分析

4 基于16SrRNA基因序列讨论

4.1 牙鱼或亚科的分属问题

4.2 叫姑鱼亚科和石首鱼亚科的进化地位

4.3 黄姑鱼属和白姑鱼属的分类地位

第三章 基于RAG1部分序列探讨中国近海十三种石首鱼类的分子系统进化关系

1. 材料

2 实验方法

2.1 DNA提取

2.2 PCR扩增

2.3 PCR扩增结果检测和记录

2.4 PCR产物纯化，克隆和测序

2.5 数据分析

3. 结果

3.1 基因组DNA提取结果

3.2 序列分析

3.3 碱基组成与遗传距离

3.4 聚类分析

4 基于RAG-1基因序列讨论

4.1 牙鱼或亚科的分属问题

4.2 叫姑鱼亚科和石首鱼亚科的进化地位

4.3 黄姑鱼属和白姑鱼属的分类地位

4.4 RAG-1基因应用于石首鱼科系统发育的适用性

第四章 结论

参考文献

附录

致谢