中华绒螯蟹胚胎超低温冷冻保存及冷冻损伤机理研究

摘要

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis），俗称河蟹、大闸蟹、毛蟹，属于节肢动物门、甲壳纲，在淡水中生长、海水中繁殖，在我国很多省市均有分布，是我国传统的水产养殖主导当家品种。近年来，随着自然环境演变、人类生产活动和适度捕捞等，我国尤其是长江中中华绒螯蟹资源量和种质急剧衰退,中下游蟹(在)逐渐消失，遗传多样性下降。水生生物配子和胚胎超低温冷冻保存作为种质资源长期保存的有效途径，具有广阔的应用前景。
　　本课题以中华绒螯蟹胚胎作为研究对象，首次将玻璃化冷冻方法引入甲壳动物胚胎的冷冻保存上，对中华绒螯蟹胚胎玻璃化冷冻保存技术和冷冻损伤机理进行了较系统的研究。分别开展了单因子抗冻剂的筛选、玻璃化液的筛选、玻璃化冷冻方法的确立、冷冻对胚胎生化成分的影响、冷冻对胚胎外部形态和内(部形态)的影响、冷冻对胚胎线粒体DNA影响等研究,主要研究结果包括以下几个方面:
　　1.中华绒螯蟹胚胎发育及几种代谢酶活性的变化
　　采用实验室内小规模实验的方法，在平均水温（16.2±1.5）℃和盐度15的条件下，对中华绒螯蟹胚胎发育过程中的形态学和几种重要代谢酶的活性变化进行了系统性研究。实验结果表明，中华绒螯蟹的胚胎发育过程可以分为9个主要阶段:受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠期、前无节幼体期、后无无节幼体期、原溞状幼体期、出膜前期和孵化期;平均水温16℃下，整个胚胎发育过程需10d左右，有效积温达到10758 h·℃。乳酸脱氢酶(LDH)、总ATPase和苹果酸脱氢酶(MDH)的活性都随胚胎发育时期的变化而变化，LDH活性呈现出先上升后下降的趋势，在囊胚期中活性最高;总ATPase活性在原溞状幼体期最高,在原肠期最低;MDH活性在原溞状幼体期最高，在囊胚期最低。
　　2.抗冻剂对中华绒螯蟹胚胎成活率的影响
　　采用二甲亚砜(DMSO)、甲醇(MeOH)、1.2-丙(二)醇(PG)和(二)甲(基)酰胺(DMF)作为四种抗冻剂，开展了中华绒螯蟹不同发育时期（细胞分裂期、囊胚期、原肠期、前无节幼体期和原溞状幼体期）在10％、15％和20％的四种抗冻剂中处理30min后胚胎的成活率研究。随抗冻剂浓度的增加，胚胎的成活率逐渐下降，细胞分裂期胚胎对抗冻剂非常敏感，胚胎分别在10％的四种抗冻剂中处理后的成活率都低于20％，显著低于对照组成活率。四种抗冻剂对胚胎表现出不同的毒性，其中DMSO对胚胎毒性最高，PG毒性最低;囊胚期胚胎对浓度为20％的抗冻剂较为敏感，胚胎在20％的MeOH和20％的DMSO中处理后都不能成活;原肠期胚胎分别在10％的四种抗冻剂中处理后，胚胎的成活率都低于50％，显著低于对照组成活率(70.6±6.8％）（P＜0.05）。胚胎在20％的四种抗冻剂中处理后都能获得成活;前无节幼体期胚胎分别在10％的四种抗冻剂中处理后，胚胎的成活率接近60％，但仍显著低于对照组胚胎成活率(83.9±8.1％)(P＜0.05)，胚胎分别在10％的四种抗冻剂处理后，相互间成活率没有显著性差异(P＞0.05);原溞状幼体期胚胎对抗冻剂表现出较强的耐受性，胚胎在10％的四种抗冻剂中处理30min后,胚胎的成活率与对照组没有显著性差异(P＞0.05)。
　　3.玻璃化液对中华绒螯蟹胚胎成活率的影响
　　在前期研究的基础上,筛选了6种玻璃化液配方(A、B、C、D、E、F)，开展了中华绒螯蟹5个不同发育时期胚胎在6种玻璃化液中分别按照二步法、三步法和五步法中平衡40min后成活率的研究。细胞分裂期胚胎经过二步平衡后在6种玻璃化液中都不能成活，在“D”号玻璃化液中经过了五步平衡后胚胎获得了最高的成活率，平均成活率为9.7±1.7％，但显著低于对照组成活率（45.4±4.5％）（P＜0.05);囊胚期胚胎经过二步平衡后在6种玻璃化液中也不能成活，在A号玻璃化液中经过五步法平衡处理后，获得了最高的成活率，平均成活率为12.8±3.4％;原肠期胚胎在B号和F号玻璃化液中经过二步平衡后不能成活，在A号、D号和E号玻璃化液中采用五步平衡法后都能获得约40％的成活率，但仍显著低于对照组成活率(70.6±6.8％)(P＜0.05);前无幼体期胚胎经过两步法处理后在6种玻璃化液中都能获得成活，胚胎在A号玻璃化液中采用三种不同的平衡方法处理后获得的成活率高于在其它几种玻璃化液中处理后的成活率;原溞状幼体期胚胎对玻璃化液表现出很高的耐受性,胚胎在A号玻璃化液中经过五步平衡后获得了最高的成活率(63.95±3.46％）
　　4.中华绒螯蟹胚胎的玻璃化冷冻保存
　　开展了中华绒螯蟹4个不同发育时期胚胎对A号玻璃化液的耐受性和玻璃化冷冻保存方法的研究,中华绒螯蟹各个时期的胚胎在A号玻璃化液中随着平衡时间的延长，其成活率逐渐下降，前无节幼体期和原溞状幼体期胚胎在玻璃化液中的适应时间较长(40-60min)。在胚胎发育过程中，不同时期的胚胎对玻璃化液的适应能力不同，细胞分裂期胚胎对玻璃化液的适应能力最低(20-30 min)，至原溞状幼体期时适应能力最强。中华绒螯蟹前无节幼体期胚胎在A号玻璃化液中平衡40 min,0.25mol/L的蔗糖分别洗脱5、10、15、20 min后，胚胎成活率无显著性差异(P＞0.05)，但洗脱10min时胚胎的成活率最高。前无节幼体期胚胎在A号玻璃化液中平衡40 min,在-196℃冷冻40min，快速解冻后用0.25mol/L的蔗糖洗脱10 min,有8个胚胎成活，成活率为9.3±2.5％，胚胎培养至第4天死亡，原溞状幼体期胚胎在A号玻璃化液中平衡40min,在-196℃冷冻1h，经相同浓度的蔗糖洗脱相同的时间，有7个胚胎成活，成活率11.3±3.6％,培养至第6天时,个孵化出膜。
　　5.玻璃化冷冻对中华绒螯蟹胚胎中三种酶活性的影响
　　运用试剂盒分别研究了中华绒螯蟹5个不同发育时期的胚胎经过6种玻璃化液处理和冷冻后胚胎中乳酸脱氢酶(LDH)、总三磷酸腺苷酶(Total ATPase)和苹果酸脱氢酶(MDH)的活性变化。玻璃化液处理不同程度地降低了不同发育时期胚胎中三种酶的活性，不同的抗冻剂对同一发育时期的胚胎酶活性有不同的影响，相同的抗冻剂对不同的发育时期胚胎三种酶活性也有不同的影响,随胚胎发育的成熟，胚胎对玻璃化液的耐受性逐渐增强，酶活性下降的幅度也逐渐减小,原溞状幼体期胚胎在6种玻璃化液中处理后MDH酶活性与对照组无显著差异(P＞0.05)。经过玻璃化冷冻保存后，不同时期胚胎中的酶活性与对照组和各处理组相比均显著下降，在胚胎发育的早期，酶活性都呈现出急剧下降的趋势，晚期胚胎酶活性下降的幅度则有所减缓，与不同时期各处理组中胚胎酶活性相比，玻璃化冷冻对各时期胚胎中LDH活性的影响低于总ATPase和MDH。
　　6.玻璃化冷冻对中华绒螯蟹胚胎外部形态和内部结构的影响
　　运用石蜡切片技术、扫描电镜和透射电镜等观察了中华绒螯蟹不同发育时期的胚胎经过玻璃化液处理和冷冻后外部形态和内部结构的变化,细胞分裂期胚胎存玻璃化液中经过二步平衡法处理后吸水膨大明显，三步平衡后胚胎外形与对照无明显区别，经过超低温冷冻后，部分卵黄物质从细胞中溢出，细胞破损严重原肠期和原溞状幼体期胚胎在玻璃化液中经过(三)步平衡法处理后,胚胎外部形态与对照无明显变化。扫描电镜观察，经玻璃化液处理后的原肠期胚胎表皮起皱成沟壑状，形成一层网状结构;透射电镜观察，处理后胚胎细胞内出现白色团块,细胞边缘变得粗糙有突起。经过冷冻保存后,胚体颜色变为粉红色，胚胎由原来的透明变成不透明状，细胞膜边缘模糊呈绒毛状,胚体内部分卵黄物质碎裂成颗粒状，细胞表面凹陷皱缩;组织切片观察，胚胎细胞外面的膜脱落破损，胚层内有大小不一的冰腔，细胞内出现明显的空泡;透射电镜下，细胞内冰腔清晰可见,空泡形成，部分线粒体和内质网解体，细胞破裂非常明显。原溞状幼体期胚胎经过玻璃化液处理后，显微摄像和扫描电镜下观察，胚胎外部形态与对照都无明显区别，但经过超低温冷冻后，部分组织呈弥散状，部分卵黄物质碎裂成颗粒状,胚胎的细胞膜脱落，胚层内出现很多冰腔和空泡;扫描电镜下，部分胚胎表面皱缩凹陷，但仍有少数胚胎表皮保持光滑完整
　　7.玻璃化冷冻对中华绒螯蟹胚胎线粒体DNA的影响
　　研究了5种玻璃化液处理和冷冻对中华绒螯蟹细胞分裂期胚胎线粒体DNA的影响。经过玻璃化液处理和冷冻后，中华绒螯蟹胚胎线粒体上的Cytb基因均能被稳定扩增，PCR电电泳产物大小约1600bp，产物经回收后进行双向测序、比对和校正,获得10条Cytb基因全序列，长度为1135bp，其中有5个核苷酸变异位点,1135bp的Cytb基因序列一共编码378个氨基酸残基，从ATG第一位起始密码子开始到1140位终止。经过玻璃化液处理和冷冻后，胚胎线粒体上的COI基因也能被稳定扩增，PCR电泳产物大小约1600bp，产物经回收后进行双向测序、比对和校正，获得10条COI基因全序列，长度为1534bp，其中有6个核苷酸变异位点，1534bp的COI基因序列一共编码511个氨基酸残基，从ATG第一位密码子开始到1533位终止。经过处理和冷冻后，中华绒螯蟹胚胎线粒体上Cytb和COI基因共有11个位点发生了变异，发生的碱基变异中存在4种类型,即G→A、A→G、C→T、T→C,变异间只有转换发生，没有颠换发生，这些变异均未引起相应氨基酸残基的变异。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 水生生物种质资源保存的重要性和研究成果

1．1．1 水生生物种质资源保存的重要性

1．1．2 鱼类胚胎冷冻保存的主要成果

1．2 鱼类胚胎冷冻保存方法的研究

1．2．1 程序化冷冻保存

1．2．2 玻璃化冷冻保存

1．2．3 胚胎时期的选择

1．2．4 玻璃化液的筛选

1．2．5 玻璃化液添加方式和脱除方法的研究

1．2．6 玻璃化冷冻保存方法

1．2．7 解冻方法

1．2．8 反玻璃化研究

1．3 水生生物胚胎冷冻损伤研究

1．3．1 渗透压损伤

1．3．2 冷休克损伤

1．3．3 冰晶损伤

1．3．4 抗冻剂毒性

1．3．5 复温过程中的细胞损伤

1．4 水生生物胚胎超低温冷冻保存研究的目的与意义

1．4．1 探索水生生物种质资源长期保存的途径

1．4．2 开展水生生物胚胎低温生物学基础研究

1．4．3 建立水生生物胚胎玻璃化冷冻技术

1．4．4 与生物技术相结合，促进其它学科的发展

1．5 本研究的技术路线与目的意义

第二章 中华绒螯蟹胚胎发育及几种代谢酶活性变化研究

2．1 胚胎发育特征

2．1．1 前言

2．1．2 材料与方法

2．1．3 结果

2．1．4 讨论

2．2 胚胎发育过程中三种代谢酶活性的变化

2．2．1 前言

2．2．2 材料与方法

2．2．3 结果与分析

2．2．4 讨论

第三章 中华绒螯蟹胚胎的超低温冷冻保存研究

3．1 单因子抗冻剂对胚胎成活率的影响

3．1．1 前言

3．1．2 材料和方法

3．1．3 结果与分析

3．1．4 讨论

3．2 玻璃化液对中华绒螯蟹胚胎成活率的影响

3．2．1 前言

3．2．2 材料与方法

3．2．3 结果与分析

3．2．4 讨论

3．3 中华绒螯蟹胚胎的玻璃化冷冻保存

3．3．1 前言

3．3．2 材料与方法

3．3．3 结果与分析

3．3．4 讨论

第四章 玻璃化保存对中华绒螯蟹胚胎三种酶活性的影响

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 材料来源和饲养方法

4．2．2 观察与记录

4．2．3 玻璃化液配方

4．2．4 胚胎处理和样品制备方法

4．2．5 酶活性测定

4．2．6 数据分析

4．3 结果与分析

4．3．1 玻璃化液处理和冷冻对不同时期胚胎中LDH酶活性的影响

4．3．2 玻璃化液处理和冷冻对不同时期胚胎中总ATP酶活性的影响

4．3．3 玻璃化液处理和冷冻对不同时期胚胎中MDH酶活性的影响

4．4 讨论

4．4．1 抗冻剂对中华绒螯蟹胚胎中酶活性的影响

4．4．2 超低温冷冻对中华绒螯蟹胚胎中酶活性的影响

第五章 超低温冷冻对中华绒螯蟹胚胎形态结构的影响

5．1 前言

5．2 材料和方法

5．2．1 材料来源与饲养方法

5．2．2 观察与记录

5．2．3 胚胎冷冻过程

5．2．4 形态结构观察方法

5．3 结果与分析

5．3．1 外部形态的变化

5．3．2 内部结构的变化

5．4 讨论

第六章 超低温冷冻对中华绒螯蟹胚胎线粒体DNA的影响

6．1 前言

6．2 材料与方法

6．2．1 材料来源与饲养条件

6．2．2 观察与记录

6．2．3 玻璃化液配制

6．2．4 胚胎处理和冷冻方法

6．2．5 胚胎线粒体中Cytb和COI基因序列测定

6．2．6 数据分析

6．3 结果与分析

6．3．1 中华绒螯蟹胚胎总DNA提取结果

6．3．2 Cytb基因序列特征分析

6．3．3 COI基因序列特征分析

6．4 讨论

第七章 结论

7．1 主要研究结果

7．2 论文的研究特点与创新点

7．3 研究工作不足之处与下一步设想

参考文献

附录一：缩略语表

附录二：发表与完成的论文

附录三：申请和授权的专利

附录四：主持和参加的相关课题

致谢