半滑舌鳎精巢细胞系的建立、鉴定及初步应用研究

摘要

鱼类细胞培养始于上世纪60年代，自从1962年第一个鱼类细胞系，虹鳟性腺细胞系-RTG-2建立以来，截止到2011年5月全世界已经建立了近300种鱼类细胞系，我国(包括大陆和台湾)迄今建立的鱼类细胞系近60种，拥有广泛的材料来源，主要包括鱼类的吻端、肾脏、卵巢、尾鳍、鳔、性腺、肝脏、胚胎(囊胚、原肠胚等)、鳍条、鳃盖膜等。
　　 半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)隶属于鲽形目(Pleuronectiformes)舌鳎科(Cynoglossidae)，是近年来我国新开发的一种特有的、理想的增养殖对象。半滑舌鳎除了具有经济价值极高的优点外，其特殊的ZZ/ZW性别决定系统又决定了它是研究鱼类性别决定机制的理想材料。成鱼精巢中精子发生又是研究干细胞更新和分化的理想系统，因为整个精子发生过程受到生殖腺体细胞的调控。
　　 由于缺少半滑舌鳎性腺细胞系这种良好的表达载体，探索性别决定基因表达调控网络的工作不能够深入开展。为了更好的开展半滑舌鳎精子发生和性别相关的机制研究，本文对半滑舌鳎两种组织培养条件进行了摸索并利用培养的细胞进行了初步的应用研究。首先，短期培养半滑舌鳎外周血淋巴细胞，在此基础上开展了染色体制备进行性别鉴定等应用性研究；其次，建立了半滑舌鳎精巢体细胞系，从细胞水平、分子水平对该细胞系进行了鉴定，并利用已经建立的精巢细胞系进行转基因、病毒敏感性实验。具体工作内容如下：
　　 1.建立了半滑舌鳎外周血淋巴细胞体外分离、培养及染色体制备方法，确立的最佳条件为：在24℃的环境中半滑舌鳎血淋巴细胞在添加20％胎牛血清的MEM培养基中，用终浓度为0.3mg/mL的LPS为刺激源培养72h，在结束培养前3h加入终浓度0.08μg/mL秋水仙素，可获得较多、较好的染色体分裂相。对血淋巴细胞染色体制片、生理解剖观察、性腺组织石蜡切片、性腺细胞培养观察、AFLP雌性特异分子标记等方法进行了比较，确定了适宜各阶段不同类型鱼的性别鉴定方法，丰富了半滑舌鳎活体遗传性别鉴定的方法。具体总结如下：培养细胞染色体制片和AFLP雌性特异分子标记的方法用于鉴定半滑舌鳎的遗传性别，二者均可以活体取材进行鉴定，准确率高，且适合于不同发育阶段和状况的个体，染色体法还可以用来鉴定半滑舌鳎的超雌鱼；生理解剖、性腺组织切片和性腺细胞观察法用于鉴定半滑舌鳎的生理性别，尽管操作简单但都需剖杀鱼体，难以获得连续性的实验数据，其中性腺组织切片和性腺细胞观察法准确率高，生理解剖观察最简便，但存在肉眼误差。
　　 2.利用组织块培养法建立了半滑舌鳎精巢体细胞系，命名为CSGC。在温度为24℃，胎牛血清浓度为20％的MEM培养基中该细胞系生长良好，细胞形态是典型的成纤维样，于首次接种后26天汇合成单层并铺满瓶底。传代周期约为3-5天，目前已经传至55代，仍然具有旺盛的增殖能力。该细胞系具有正常的二倍体染色体核型，具有2n=42的染色体核型，缺乏W异性染色体，AFLP雌性特异分子标记检测显示，该细胞系无雌性特异的条带，从分子水平确定了该细胞系的来源个体的遗传性别为雄性，排除了来源于伪雄个体的可能性。利用精巢体细胞分子标记dmrt1基因检测，证明该细胞系来源于精巢组织，且为体细胞而非生殖细胞。
　　 运用脂质体转染法对CSGC细胞系进行转EGFP和EGFP-grim19的实验，可以看到强荧光表达，经计数，转染效率超过50％，说明CSGC细胞是基因转染的良好载体。病毒敏感性实验证明该细胞系对大菱鲆虹彩病毒和淋巴囊肿病毒敏感，光学显微镜下24h后即能观察到明显的病理学效应。病毒衣壳蛋白分子检测显示感染牙鲆淋巴囊肿病毒的扩增产物中特异性的条带大小为490bp，而感染大菱鲆虹彩病毒(TRBIV)的特异性条带出现在780bp。24h后电镜检测两种病毒颗粒出现在CSGC细胞胞质中，说明病毒颗粒侵入CSGC细胞，再次证明该细胞系是研究病毒与宿主细胞相互作用的理想的工具。
　　 本文探索了半滑舌鳎两种组织细胞培养方法，并利用培养细胞在染色体制备、性别鉴定、转基因、病毒敏感性方面开展了初步的应用性研究，为今后进行半滑舌鳎超雌鱼鉴定、染色体基因定位、荧光原位杂交、病毒与宿主细胞相互作用机制等研究奠定了基础。