大珠母贝和企鹅珍珠贝组织蛋白酶D基因及α-淀粉酶基因的克隆与表达分析

摘要

大珠母贝(Pinctadamaxima)分布于中国、澳大利亚和东南亚沿岸热带和亚热带海域，是世界上最优质的育珠贝，具有极高的经济价值。企鹅珍珠贝(Pteriapenguin)主要分布于我国两广、海南、台湾沿海以及日本九州的南部，琉球群岛直至菲律宾等地，主要用于培育附壳珠和大型游离珍珠。
　　 本研究通过同源克隆方法获得了大珠母贝和企鹅珍珠贝的组织蛋白酶D基因和a-淀粉酶基因，并对其序列特征和组织表达进行了分析；为进一步研究组织蛋白酶D在免疫方面的功能和作用机理奠定基础，为探讨大珠母贝养殖死亡原因积累资料；为筛选a-淀粉酶基因的SNP多态位点、开展SNP多态位点和生长性状的关联分析奠定基础。
　　 主要结果如下：
　　 1、通过同源克隆方法和cDNA末端快速扩增技术(RACE)，获得了大珠母贝(Pinctadamaxima)组织蛋白酶D基因(命名为pmCTSD)的cDNA全长序列1742bp，其中5，非翻译区(UTR)38bp，3’UTR534bp，开放阅读框1170bp，编码390个氨基酸，分子量约为41.9ku，等电点约为7.57。序列特征分析表明，pmCTSD蛋白由信号肽(Met1-Ala18)、前体域(Leu19-Lys47)和成熟域(Thr4s-Asn390)3部分组成。同源性分析表明，pmCTSD氨基酸序列与其他物种高度保守，一致性介于64％～70％之间。进化分析表明，pmCTSD与栉孔扇贝亲缘关系最近，与传统分类结果基本一致。组织表达荧光定量分析发现，pmCTSD在闭壳肌、性腺、肝胰脏、外套膜和鳃组织中都有表达，但在性腺中表达量最高，肝胰脏次之。经哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)浸泡刺激6h后，pmCTSD基因的mRNA表达水平在肝胰脏中表达量最高并略有上升但差异不显著(P>0.05)，在其他组织中表达量均很低，其中性腺显著下调(P<0.01)。上述结果为进一步开展pmCTSD的功能研究奠定了重要基础。
　　 2、企鹅珍珠贝组织蛋白酶D基因(命名为pgCTSD)cDNA全长1，767bp，其中5，UTR为38bp，3，UTR为553bp，ORF1，176bp，编码392个氨基酸，包括信号肽(Met1-Ala18)、前体域(Leu19-Lys47)和成熟域(Tyr48-Ser392)3部分，分子量为42.3KDa，等电点为8.04。pgCTSD一级结构包含2段天冬氨酸蛋白酶签名序列(Val84-Val95和Ala272-Gly283)、2个N-连接的糖基化位点(Asn124和Asn237)。pgCTSD与大珠母贝的一致性最高(79％)，与其他物种的一致性在59％～75％之间。NJ树表明企鹅珍珠贝与栉孔扇贝聚在一小支，然后与大珠母贝聚在一起。荧光定量分析表明，空白组中pgCTSDmRNA在闭壳肌、性腺、肝胰脏、外套膜和鳃组织中都有表达，且在闭壳肌中表达量最少，肝胰脏中最高。与空白组相比，注射PBS6h后，pgCTSDmRNA在闭壳肌和性腺的表达量显著上调，肝胰脏下调，但在各组织中保持最高表达量，外套膜和鳃组织显著下调。与对照组相比，LPS刺激6h后，闭壳肌的表达量显著上调，性腺和肝胰脏显著下调，外套膜和鳃组织变化不显著；哈维氏弧菌刺激6h后，在鳃组织中显著上调，外套膜中显著下降，性腺中无显著变化。上述结果为进一步开展pgCTSD的功能研究奠定了重要基础。
　　 3、首次获得大珠母贝α-淀粉酶基因(命名为pmAMY)的cDNA全长1，732bp，其中5，UTR25bp，ORF1，554bp，编码518个氨基酸，3’UTR153bp，分子量为57.7KDa，等电点7.63。序列分析表明pmAMY的氨基酸序列包括16个氨基酸组成的信号肽(Met1-Gly16)，序列为MLUVCSIAFFHsVYG；8个半胱氨酸位点(Cys46、Cys104、Cys157、Cys176、Cys392、Cys398、Cys464、Cys476)、3个活性催化位点(Asp213、Glu249、Asp314)、4个钙结合位点(Asnus、Arg174、Asp183、His217)、3个氯离子结合位点(Arg211、Asn312、Arg350)和4段保守序列(Ile111-Val116、Val207-Ala215、Phe247-Val251、Val308-Asn315。pmAMY与长牡蛎(Crassostreagigas)一致性最高达79％，与其他物种的一致性在57％～62％之间。克隆获得大珠母贝pmAMY基因序列，含3个外显子和2个内含子。其中第一外显子117bp，编码39个氨基酸；第二外显子152bp，编码50个氨基酸；第三外显子1，288bp，编码429个氨基酸。第一个内含子846bp，第二个内含子162bp。大珠母贝pmAMY基因的2个内含子都起始于GT，终止于AG，符合内含子共同剪接位点序列。
　　 4、企鹅珍珠贝α-淀粉酶基因(命名为pgAMY)cDNA全长1，670bp，其中5’UTR18bp，3，UTR83bp，ORF1，569bp，编码523个氨基酸，分子量为62.4KDa，等电点8.7。序列分析表明pgAMV包括20个氨基酸组成的信号肽(Met1-Gly20)，序列为MRTFFLTVCVLVLHSTVG：8个半胱氨酸位点(Cys50、Cys108、Cys162、Cys181、Cys397、Cys403、Cys469、Cys481)、3个活性催化位点(Asp218、Glu254、Asp319)、4个钙结合位点(Asn122、Arg179、Asp188、His222)、3个氯离子结合位点(Arg216、Asn317、Arg355)和4段保守序列(Ile115-Val120、Val212-Ala220、Phe252-Val256、Val313-Asn32。pgAMY与长牡蛎一致性最高为83％，与大珠母贝一致性为82.8％，与其他物种的一致性在57％～67％之间。饥饿实验中对照组pgAMY的表达量最高，2-△△CT值为1。饥饿1周后表达量下降到对照组的43％(P<0.5)，饥饿4周后表达量与饥饿1周无明显变化，为对照组的51％，投喂1天后pgAMY的表达量与饥饿4周的相比稍有下降，为对照组的39％。不同盐度刺激24h后，盐度33的pgAMY表达量最高，盐度40其次，2-△△CT值分别为3.52、3.46，从盐度30开始pgAMY表达量随盐度下降而下降，2-△△CT值分别为2.68、2.01、1.81、1.01。随刺激时间延长，盐度25和40的pgAMY表达量均下降，两个盐度组刺激1、2、3天后的表达量分别为2.01、1.92、0.44和3.46、1.39、0.92。