草鱼肌肉生长抑制素2的克隆、功能分析以及Tgf2转座子介导的鱼类插入诱变研究

摘要

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国四大家鱼之一,年产量接近400万吨,其研究很受重视。而草鱼肌肉作为草鱼的主要食用部位,其生长和发育调控的研究逐渐成为研究的热点。myostatin基因编码 MSTN蛋白,是高等脊椎动物(如小鼠和畜禽)肌肉生长的关键性负性调控因子,该基因对同属脊椎动物的硬骨鱼类肌肉的生长发育也可能扮演着重要的作用。在高等脊椎动物中只发现存在1个 MSTN基因即 mstn1,而在有些鱼类中不仅存在 mstn1,还存在第2个 mstn2基因。在草鱼中,是否存在 mstn2基因及其在草鱼肌肉生长发育过程中的功能目前尚不清楚。
　　本研究在草鱼中克隆到了 MSTN2 cDNA,全长为1976bp,可编码364个氨基酸。胚胎不同时期的RT-PCR结果显示,MSTN2 mRNA在草鱼胚胎发育各阶段均有表达,但早期表达量较低,中后期表达量逐步升高。在草鱼早期胚胎的原位杂交中没有检测到信号,而在草鱼胚胎发育的中期,脑和脊索中可检测到微弱表达,在后期胚胎中表达信号增强。RT-PCR结果显示,MSTN2 mRNA在草鱼脑、肌肉、性腺、肝脏和眼中均有表达,其中在脑中表达量较高,而在其它组织中则没有表达。在受精卵中显微注射 MSTN2的5’加帽 mRNA对草鱼胚胎的早期发育影响不大,但后期草鱼胚胎体形扭曲、尾巴弯曲,并呈现出明显的畸形;对过表达36h后的草鱼胚胎用肌肉发育相关的myoD,myoG,ntl探针进行原位杂交,发现 MSTN2的增加可造成草鱼肌节扭曲膨大、体轴弯曲及肌肉发育障碍。这些结果表明,与 MSTN1基因类似,草鱼 MSTN2对草鱼的肌肉生长发育也起着重要的调控作用。基于MSTNs对草鱼肌肉生长起着明显的抑制作用,本研究还进一步开展了 MSTN1基因反义 mRNA敲降的初步研究。利用我们自主开发的鲤科鱼类 Tgf2转座子,构建了 MSTN1的反义敲降载体—pTgf2-EF1α-antimstn1,通过与编码转座酶的辅助质粒共同显微注射到草鱼、鲫鱼和团头鲂的受精卵(1-2细胞期)中,以获得反义 mstn1表达的转基因后代,从而实现内源性 mstn1基因的敲降。初步的研究结果显示,转反义 mstn1的阳性鱼比非转基因的阴性鱼体重增加显著(P<0.05),表明了草鱼 mstn基因在草鱼肌肉生长发育中的负调控作用。
　　本文还开展了 Tgf2转座子介导的鱼类插入诱变研究。以 Tgf2转座子为基础,分别构建了带有4种不同启动子的供体质粒——pTgf2-EF1α-eGFP、pTgf2-Krt8-eGFP、pTgf2-βactin-eGFP和pTgf2-MyoD-eGFP,以及辅助质粒 pCS2-β-actin-gfTP,将供体质粒和辅助质粒或转座酶 mRNA共同注射到草鱼、鲫和团头鲂的受精卵中,初步建立了一个转座子介导的插入诱变库。研究结果显示,在鲫和团头鲂的早期胚胎中,荧光率达到90％,在草鱼中则达到95%。随着注射的供体质粒的不同,表现出不同的荧光特征——肌肉荧光、表皮荧光及全身荧光,eGFP在平游期的整合率平均为53%,在1龄阶段的整合率在35%左右。共得到草鱼插入诱变突变体阳性个体162尾,其中有明显表型差异的45尾;鲫鱼插入诱变突变阳性个体60尾,其中有明显表型差异的14尾;团头鲂插入诱变阳性个体51尾,其中有明显表型差异的10尾。这些鱼类转座子插入诱变突变体可为目标性状功能基因的挖掘和功能机制研究积累一定的基础。

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引 言

第一章 草鱼肌肉生成抑素 MSTN2 的克隆及功能研究

1.1 材料，仪器和试剂

1.2 方法

1.3 结果

1.4 讨论

第二章 鱼类肌肉生成抑素的反义链 antimstn1 的转基因研究

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第三章 Tgf2 转座子介导的养殖鱼类插入诱变研究

3.1 材料，仪器与试剂

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

结论与展望

参考文献

致谢