魁蚶微卫星富集文库的构建及四个地理群体的遗传多样性分析

摘要

本文以魁蚶(Scapharca broughtonii)为实验材料,采用磁珠富集法构建魁蚶微卫星序列基因组文库,经过优化 PCR反应筛选分离出48对扩增条带清晰稳定,多态性较高的微卫星标记。选取其中20对引物分析了魁蚶的4个地理群体(日照、蓬莱、黄岛、韩国)间的遗传多样性、遗传分化及遗传距离等。论文的主要研究结果如下:
　　1.利用磁珠富集法筛选魁蚶微卫星标记,并对所得标记进行了分析。通过MspⅠ酶切魁蚶基因组 DNA,收集400-1200bp的片段,通过生物素标记的寡核苷酸探针(AC)15、(AG)15捕捉含有微卫星序列的DNA片段,然后连接到 pMD18-T载体中,转化至 TOP10大肠杆菌中,构建魁蚶微卫星序列富集文库。随机选取890个菌落,经菌落 PCR检测阳性克隆,筛选出295个阳性克隆进行测序,结果208个含有微卫星序列。其中完美型147个,占70.7％,非完美型35个,占16.8%,混合型26个,占12.5%。重复次数5~31次,重复单元以 AG、AC为主。利用软件共设计出140对微卫星引物,其中能扩增出稳定条带的102对,表现为多态性的48对。
　　利用30个魁蚶对筛选出的48个微卫星标记进行多态性分析和遗传信息的评价,共获得了375个等位基因,不同位点获得的等位基因数目从2~14个不等,平均每个位点获得7.8个等位基因。观测杂合度、期望杂合度及多态信息含量(PIC)的范围分别是0.1034~0.9655,0.1831~0.9208,0.1638~0.8946,结果表明所筛选的微卫星标记大部分具有较高的多态性。
　　2.从筛选的48对多态性标记中选取20对微卫星引物,对中国日照、蓬莱、黄岛和韩国的4个魁蚶群体进行遗传多样性分析。共扩增得到196个等位基因,不同引物等位基因数为5~17,平均等位基因数为9.8,平均有效等位基因数为7.3540。
　　计算各位点的多态信息含量(PIC),20个位点在4个群体中 PIC值介于0.6720~0.9224之间,平均值为0.8357,均大于0.5,呈高度多态性,表明各位点在魁蚶群体中均表现出高的遗传多样性水平,所选微卫星引物可以用于群体间的遗传关系鉴定。
　　各群体平均观测杂合度(Ho)范围在0.7039~0.8265之间,平均期望杂合度(He)范围在为0.8333~0.8524之间;20个位点在4个群体中反应的杂合度有所差异,位点 KH-42、KH-43在群体中的观测杂合度最高,为0.8974,位点 KH-26在群体中的观测杂合度最低,为0.5741。位点 KH-26在各群体中均显著或极显著偏离Hardy-Weinberg平衡,除部分位点分别在不同群体中出现显著或极显著偏离外,其余位点均符合 HW平衡。
　　群体间遗传分化指数 Fst在0.0132~0.0314之间,黄岛-韩国群体分化最大(0.0314),日照-黄岛群体分化最小(0.0132)。4个群体的遗传分化指数均小于0.05,表明各群体间的遗传分化为低度分化。通过计算遗传相似性指数和遗传距离表明,魁蚶4个群体间遗传相似性指数为0.7821~0.8820,遗传距离为0.1255~0.2458。其中,日照群体和黄岛群体遗传相似性指数最高,为0.8820,遗传距离最近,为0.1255;黄岛群体和韩国群体遗传相似性指数最低,为0.7821,遗传距离最远,为0.2458。基于群体间遗传距离构建 UPGMA聚类分析树,显示日照群体和黄岛群体最先聚类,两群体间亲缘关系最近,再与蓬莱群体聚类,最后与韩国群体聚类,说明中国群体与韩国群体亲缘关系较远。
　　本研究开发的微卫星标记及群体分析所得数据为后续魁蚶遗传育种、种质资源保护、种群遗传多样性、遗传连锁图谱的构建和QTL定位等研究工作提供基础资料,为最终实现魁蚶的分子标记辅助育种奠定了一定的基础。

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引 言

第一章 文献综述

1. 魁蚶概述

2. 分子遗传标记概述

3. 微卫星分子标记概述

4. 魁蚶的遗传多样性研究概况及意义

第二章 魁蚶微卫星富集文库的构建

1. 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 样品来源

2. 实验结果

3. 讨论

第三章 魁蚶多态性微卫星标记的筛选及评价

1. 微卫星标记筛选

2. 多态性微卫星标记的筛选

3. 多态性微卫星标记的评价

4. 讨论

第四章 魁蚶四个地理群体遗传多样性微卫星分析

1. 材料与方法

2. 结果与分析

3. 讨论

小 结

参考文献

附 录

硕士期间论文发表情况和获奖情况

致谢