“粉玉”体色瓯江彩鲤MHCⅡ类基因多态性与鱼体抗病力的关系及补体C9基因的全长克隆与表达

摘要

本研究以“粉玉”体色瓯江彩鲤为对象,人工感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后,一方面分析主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex, MHC)II类α和β基因多态性及其与鱼体抗病力之间的关系;另一方面,采用 RACE技术,获得补体 C9基因 cDNA的全长序列,并通过实时荧光定量PCR技术检测了C9基因在各正常组织及感染嗜水气单胞菌后不同时段的组织表达情况。研究结果将为“粉玉”体色瓯江彩鲤的抗病育种提供重要的基础资料。
　　主要研究结果如下:
　　1、MHC class Iiβ基因的多态性及其与鱼体抗病力的关系
　　从30尾感病和13尾抗病“粉玉”体色瓯江彩鲤的cDNA中扩增出长度为624 bp的MHC class Iiβ基因片段。对210个有效克隆进行测序,获得84个不同的编码序列,分属13个不同的等位基因,其中Cyca-DAB3*17和Cyca-DAB3*18为新发现的2个等位基因。核苷酸、氨基酸变异位点总数为267、130,变异率较高(42.79％、62.50%)。MHC class Iiβ基因片段包括第1-4个外显子,分别编码信号肽、β1和β2结构域及跨膜区。Β1结构域的变异明显大于β2结构域,表现为在长度为276 bp的β1结构域中,核苷酸、氨基酸变异位点分别为150个(54.35%)和72个(78.26%);而长度为282 bp的β2结构域的核苷酸、氨基酸变异位点较少,分别为105个(37.23%)和54个(57.45%)。在β1结构域的24个抗原结合位点(Peptide binding region,PBR)上,有22个发生了变异。Β1结构域的PBR、非抗原结合位点(non-PBR)及β2结构域的非同义碱基替换率(dN)与同义碱基替换率(dS)的比值ω分别为1.366、0.992、0.792,表明“粉玉”体色瓯江彩鲤MHC class Iiβ基因的β1结构域在进化过程中受到正向选择作用。基因Cyca-DAB3*09在抗病群体中出现的频率(7.81%)显著高于感病群体(1.37%, P<0.05),新等位基因Cyca-DAB3*18(频率为3.13%)只出现在抗病群体中,基因Cyca-DAB1*08、Cyca-DAB3*08和Cyca-DAB3*17为感病群体所特有。
　　2、MHC class Iiα基因的多态性及其与鱼体抗病力的关系
　　对43尾“粉玉”体色瓯江彩鲤的207个有效克隆进行测序,获得105条不同的MHC class Iiα编码序列,分属11个不同的等位基因,Cyca-DXA13、Cyca-DXA14、Cyca-DXA15和Cyca-DXA16为新发现的4个等位基因。核苷酸、氨基酸变异位点总数为214、109,变异率较高(34.29%、52.40%)。MHC class Iiα基因片段的长度为624bp,包括第1-4个外显子,分别编码33bp的信号肽、252bp的α1和285bp的α2结构域及54bp的连接肽/跨膜区。Α1结构域的变异明显大于α2结构域,表现在α1结构域中核苷酸和氨基酸变异位点比例(40.87%和61.9%)远高于α2结构域的变异位点比例(31.58%和51.58%)。在α1结构域的21个抗原结合位点(PBR)上,有17个发生了变异。Α1结构域的PBR区的非同义碱基替换率(dN)与同义碱基替换率(dS)的比值ω为5.186,远远高于非抗原结合位点(non-PBR)及β2结构域的0.796、0.531,表明“粉玉”体色瓯江彩鲤MHC class Iiα基因的α1结构域在进化过程中受到正向选择作用。等位基因 Cyca-DXA5和Cyca-DXA10在抗病群体中出现的频率极显著高于其在感病群体中出现的频率(P<0.01);新等位基因 Cyca-DXA15为抗病群体所特有,且出现的频率(4.62%)达到了极显著水平(P<0.01);而等位基因 Cyca-DXA8在感病群体中出现的频率(19.72%)极显著高于其在抗病群体中出现的频率(1.54%, P<0.01)。组织表达分析结果表明,MHC Iiα基因在健康鱼的肝脏中表达量最高,其次是脾和肌肉,肠中的表达量最低。感染嗜水气单胞菌后,MHC Iiα基因在肝和脾中的表达量均急剧下降,在感染后72h和96h又呈现上升的趋势。而肾在感染12h内表现出应急反应,表达量上升,随着时间的推移,表达量又降低。
　　3、补体C9基因的全长克隆与表达分析
　　补体C9是构成膜攻击复合体直接导致靶细胞溶溃的重要组成成分。我们采用RACE技术,首次成功克隆出“粉玉”体色瓯江彩鲤补体C9基因的cDNA全长。该序列全长2158bp,包括24bp的5′-UTR、2022bp的开放阅读框(Open reading frame, ORF)和112bp的3′-UTR,编码一个由674个氨基酸组成、分子量为73.16kDa的前体蛋白,第1-19个氨基酸为信号肽,在3′-UTR PolyA尾上游57bp处出现一个多聚腺苷酸加尾信号AATAAA。序列分析表明,“粉玉”体色瓯江彩鲤C9基因具有TSP、LDL-R、MACPF和EGF样等4个保守结构域。C9的蛋白序列含有28个保守的半胱氨酸残基,第256位存在一个长度为74个氨基酸的富含甘氨酸(Glycine, Gly)的区域。系统进化分析表明,“粉玉”体色瓯江彩鲤 C9的氨基酸序列,与草鱼(Ctenopharyngodon idella)的相似性最高(77.5%),与其他鱼类的相似性在41.8%～44%之间,而与哺乳动物的相似性(33.5%～36.7%)则较低。半定量结果显示,C9基因在健康“粉玉”体色瓯江彩鲤的肝、脾和肾中有表达,其中肝脏中的表达量最高,其次是脾。实时荧光定量 PCR检测的结果显示,感染嗜水气单胞菌后,12h内肝脏中的表达量激增,24h时又骤减,随后又增高,72h时表达量升高至正常水平的20.80倍,96h时又降到3.03倍。在脾和肾中,感染24h内表达量持续上升,24h时达到最高,随后又急剧降低,到96h时基本降为正常水平的0.5倍左右。可见,C9基因在“粉玉”体色瓯江彩鲤肝、脾和肾组织中C9基因的表达变化情况与嗜水气单胞菌的侵染紧密相关,揭示其在鱼体免疫反应中的重要作用。

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引言

1．瓯江彩鲤研究概况

2. 主要组织相容性复合体研究进展

3. 补体C9基因的研究进展

4. 本研究的目的与意义

第一章：“粉玉”体色瓯江彩鲤MHC II类基因多态性及其与鱼体抗病力的关系

第一节：MHC class IIβ基因多态性及其与鱼体抗病力的关系

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节：MHC class IIα基因的多态性、表达及与鱼体抗病力的关系

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二章 “粉玉”体色瓯江彩鲤补体C9基因的全长克隆与组织表达分析

1 材料与方法

2 结 果

3 讨论

全文小结

参考文献

附录1

硕士在读期间发表及拟投稿论文

致谢