牙鲆抗淋巴囊肿病相关微卫星标记的筛选及两种免疫相关基因的克隆与初步分析

摘要

牙鲆（Paralichthys olivaceus）是我国重要的海水养殖鱼类，经济价值较高，被广泛养殖。近年来，随着牙鲆养殖规模不断壮大，各种病害频繁发生。为了牙鲆养殖业的健康稳定发展，应采取传统育种与分子手段相结合的手段培育性能更好的新品种。本文以牙鲆为材料，筛选出了与牙鲆抗淋巴囊肿病相关的微卫星标记，并对两种免疫相关基因进行了克隆及初步分析。得到了一以下结果:
　　Ⅰ、牙鲆抗淋巴囊肿病相关微卫星分子标记的筛选
　　为了筛选出中国牙鲆群体的抗淋巴囊肿病相关 SSR标记，采用分群分析法对102个牙鲆个体（感病56个，抗病46个）进行了抗淋巴囊肿病相关SSR标记的筛选。首先构建了抗、感基因池（抗病个体和感病个体各15个），并利用178对微卫星引物对其进行了扫描；对于在抗、感池间扩增出差异条带的引物，用构成抗、感池的30个个体对其进行了第一次单个体验证；对于在第一次单个体验证中差异显著的引物用102个个体进行了第二次验证。结果显示，有4对引物（scaffold440_22585、scaffold826_5003、scaffold703_4284和scaffold185_597）在抗、感基因池间扩增出了差异条带；经第一次单个体验证，表明scaffold826_5003（P=0.023）和scaffold185_597（P178bp=0.028，P173bp=0.009）的差异条带在抗、感个体中呈显著性差异；经第二次单个体验证，发现scaffold185_597的差异条带在抗、感个体中出现的频率分别为60.9％和14.3%（P=0.001），差异显著；对scaffold185_597在10个抗病个体中扩出的差异条带进行了克隆并测序，经 blast比对，证实其为黄海所水产基因组与细胞工程研究室公布的牙鲆微卫星标记scaffold185_597中的一段，同源性达到96%。研究表明微卫星标记 scaffold185_597可能与牙鲆抗淋巴囊肿病相关，为中国牙鲆分子标记辅助育种提供了参考。
　　Ⅱ、牙鲆免疫相关基因的克隆与初步分析
　　选用补体相关基因C1q-like3和胞粘蛋白因子基因Cytohesin-1，采用cDNA末端快速扩增技术，对两个基因分别进行了克隆，并对其结构进行了分析。之后，对牙鲆C1q-like3基因进行了转录组水平的表达分析；并在牙鲆Cytohesin-1基因中筛查了单核苷酸多态性（SNP）位点。从而对两种免疫相关基因的功能与牙鲆抗病的关联性进行了分析。
　　1.C1ql3基因的克隆与表达分析
　　补体系统是一种重要的免疫效应系统，在先天性免疫中起着非常重要的作用。补体相关分子广泛存在，并参与宿主的免疫应答。研究克隆了牙鲆C1q-like3基因（定义为PoC1ql3）。PoC1ql3的cDNA全长1482bp，包括4bp的5’UTR，801bp的编码区和677bp的3’UTR。801bp的开放阅读框编码266个氨基酸，与其基因组序列比对发现该基因含有两个外显子和一个内含子。同源比对和进化分析表明，牙鲆C1ql3基因与斑马鱼和罗非鱼亲缘关系很近。健康组织C1ql3的实时定量分析显示PoC1ql3在肝脏和脾脏中高表达，在血液和肌肉中很少表达，并在其他组织中低表达。鳗弧菌感染后，C1ql3在肝中的表达在6h达到最高峰，在脾中则在48h上升到最大值，分别是其PBS对照组的2.89和2.64倍。细菌的感染能显著增加PoC1ql3在免疫组织中的表达，这可能说明了C1ql3与牙鲆炎症反应和自我平衡功能相关。
　　2.Cytohesin-1基因的克隆与SNP检测
　　Cytohesin-1基因在小鼠、人类等物种的研究表明，其在机体中发挥免疫功能的作用，与免疫调节具有一定的相关性。研究通过基因克隆技术获得了牙鲆Cytohesin-1基因的cDNA全长序列1631bp，包括175bp的5’UTR，1203bp的开放阅读框和253bp的3’UTR。1203bp的开放阅读框共编码400个氨基酸。cDNA序列与基因组序列比对结果显示，牙鲆 Cytohesin-1基因含有11个外显子和10个内含子。多氨基酸序列比对表明，该基因在各物种中较为保守，都含有 Sec7结构域。进化分析显示，牙鲆 Cytohesin-1基因与鲈鱼亲缘关系最近，并与其他鱼类聚为一支，与鸟类、哺乳类距离较远。采用牙鲆抗鳗弧菌病与感鳗弧菌病样本各30个，通过外显子直接测序法筛查相关SNP位点，发现外显子8多位点套峰，可能存在碱基的插入或缺失的情况，同时分别在外显子9、10和11筛查到了疑似SNP位点。筛查出的疑似SNP位点需通过进一步的验证，以确定SNP位点与疾病的关联性，以期指导育种实践。

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引言

第一章 文献综述

1 微卫星分子标记（SSR）

2 单核苷酸多态性（SNP）

3 补体的激活途径及其C1q家族的研究进展

4. Cytohesin家族的研究

5.本论文的研究目的及意义

第二章 牙鲆抗淋巴囊肿病相关SSR标记的筛选与鉴定

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果

2.4 讨论

第三章 牙鲆补体基因C1q-like 3的克隆与表达分析

3.1 引言

3.2材料与方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四章 牙鲆Cytohesin-1基因克隆与SNP位点初步筛查

4.1 引言

4.2材料与方法

4.3 结果

4.4讨论

总结与展望

参考文献

硕士期间已完成工作

致谢