大口黑鲈HBP基因和CTSB基因SNPs的筛选及与生长关联分析

摘要

大口黑鲈（Micropterus salmoides），俗名加州鲈，隶属鲈形目（Perciformes）、鲈亚目（Porcoidei）、太阳鱼科（Cehtrachidae）、黑鲈属（Micropterus），是我国重要的淡水养殖品种之一。然而近年来，养殖大口黑鲈呈现的种质衰退，生长速度下降的问题，严重制约我国大口黑鲈养殖业的快速发展。培育出具有优良生长性状的大口黑鲈养殖品种，是现阶段育种研究者的研究重点。筛选具有良好遗传性状的相关分子标记，并应用于分子标记辅助育种已经成为鱼类遗传改良的重要研究手段，也是其它动植物研究中的重要技术手段。分子标记辅助选择育种是借助分子标记对标记基因和目标性状进行关联和选择，由于是从分子的角度对性状直接准确标记，所以能够有效提高性状选择的效率，减少育种过程的泛泛的盲目选择，有效缩短育种时间。基于大口黑鲈EST-SNP库，选取高密度脂蛋白结合蛋白基因和组织蛋白酶B为与生长性状相关的候选基因，分析其单核苷酸多态性与生长性状的关联性。
　　1.高密度脂蛋白结合蛋白基因（HBP）SNPs的筛选及与生长关联分析
　　高密度脂蛋白结合蛋白（high density lipoprotein binding protein, HBP）在动物的脂肪代谢中发挥重要的作用。脂类是鱼类的重要能源物质，尤其是那些对糖类利用率很低的肉食性鱼类。HBP基因上的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)可能会影响脂肪代谢，而对大口黑鲈的生长性状产生影响，研究其SNP与生长性状的相关性可为其分子标记辅助选择提供候选标记。本研究根据大口黑鲈(Micropterus salmoides) EST-SNP库中 HBP基因的序列(GenBank accession NO.:KF652241)，用直接测序法在HBP基因3′非编码区获得了3个SNPs位点：H1(G+2782T), H2(T+2817C)和H3(G+2857A)。随机选择同批繁殖、同塘养殖的165尾大口黑鲈样本，对3个SNPs位点用SnaPshot方法进行检测和分型，分型结果用软件 Popgene32进行遗传结构分析。运用软件 spss17.0的一般线性模型（general linear model，GLM）对获得的不同基因型与生长性状进行关联分析。结果表明，3个位点均处于哈温平衡，其中 H1和H2位点组成了两种单倍型（A和B），观测到3种基因型（AA、AB和BB）；H1、H2和H3共组成6种双倍型（D1、D2、D3、D4、D5和D6）。不同基因型与生长性状的相关性分析显示，基因型BB在体质量和全长形态指标显著高于基因型AB（P＜0.05），双倍型D6在体质量和全长形态指标显著高于双倍型 D4（P＜0.05）。在大口黑鲈 HBP基因3′非编码区获得了与生长性状相关的SNPs标记，其优势基因型可应用于大口黑鲈分子标记辅助选择育种。
　　2.组织蛋白酶B基因SNP筛选及与生长性状关联分析
　　组织蛋白酶B（cathepsin B，CTSB）在动物体内以酶原形式广泛存在于溶酶体中，其能够水解多种动物蛋白和植物蛋白，该基因是研究动物的胴体和肉质性状热点基因之一。为获得大口黑鲈(Micropterus salmoides)与生长性状相关的分子标记，以大口黑鲈EST-SNP库中CTSB基因为候选基因，用直接测序法在CTSB基因编码区获得了1个SNP位点，该位点为C+598G，为错义突变（引起氨基酸种类由甘氨酸突变为精氨酸），组成基因型分别为CC、GC和GG。随机选择同批繁殖、同塘养殖的165尾大口黑鲈样本，对该位点用SnaPshot方法进行检测和分型，分型结果用软件 Popgene32进行遗传结构分析。运用软件spss17.0的一般线性模型（general linear model, GLM）对获得的不同基因型与生长性状进行关联分析。结果表明，C+598G位点的观测杂合度为0.4727，多态信息含量（PIC）为0.3539，为中度多态性，处于哈温平衡。观测到3种基因型GG、GC和CC，在随机群体中的频率分别为12.12％，47.27%和40.61%，其中等位基因G和C频率分别为35.76%和64.24%。不同基因型与生长性状的相关性分析显示，体质量、全长、体高、尾柄长、尾柄高5个性状的平均表型值均为GG型＜GC型＜CC型，其中CC个体在体质量上显著大于GG个体（P＜0.05）。大口黑鲈CTSB基因编码区获得的分子标记，优势基因型CC可作为大口黑鲈与生长相关的候选标记应用于其分子标记辅助选择。
　　本研究以大口黑鲈EST-SNP库中的HBP基因和CTSB基因为候选基因，总共筛选到4个SNPs位点，获得了2个与生长相关的SNP标记，可应用于大口黑鲈分子标记辅助选择育种，为大口黑鲈分子标记辅助选择奠定基础。

目录

封面

上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单

声明

中文摘要

英文摘要

目录

引言

1高密度脂蛋白结合蛋白基因和组织蛋白B基因

1.1高密度脂蛋白结合蛋白基因

1.2组织蛋白酶B

2.鱼类中用候选基因法筛选SNP标记进展

2.1单核苷酸多态性SNP

2.2候选基因法

2.3候选基因法在鱼类中的应用

2.4候选基因法开发的大口黑鲈SNP标记

3.分子标记辅助选择育种策略

3.1单基因选择育种

3.2多基因选择育种

3.3全基因组选择

4.研究的目的与意义

第一章大口黑鲈高密度脂蛋白结合蛋白基因（HBP）SNPs的筛选及与生长性状关联性分析

1材料与方法

1.1材料

1.2 SNPs位点筛选

1.3 SnaPshot分型

1.4数据统计分析

2结果

2.1 HBP基因部分序列的SNP位点获得和分析

2.2 HBP基因上SNPs位点在群体中的遗传结构分析

2.3 HBP基因的H1、H2和H3位点与生长性状相关性分析

3讨论

第二章大口黑鲈组织蛋白酶B基因SNP筛选及与生长性状关联分析

1材料与方法

1.1实验材料

1.2 SNPs位点筛选

1.3 SnaPshot分型

1.4数据统计分析

2结果

2.1 CTSB基因的SNP位点获得和分析

2.2 CTSB基因编码的氨基酸序列分析

2.3 CTSB基因突变位点在群体中多态性分析

2.4 CTSB基因的突变位点与生长性状相关性分析

3讨论

全文总结

参考文献

致谢

附录1中英文对照缩略词表(Abbreviations)

附录2 攻读硕士学位期间发表的论文