尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)GHSR和ghrelin基因多态性分析及其生长相关SNP标记的筛选

摘要

尼罗罗非鱼吉富品系（Oreochromis niloticus，GIFT strain）目前是我国养殖区域产量最高、分布最广的罗非鱼品种，其生长速度显著高于其他罗非鱼养殖品种。研究表明，吉富尼罗罗非鱼不同家系间或同一家系不同个体间的生长速度存在较大差异，且形态上也存在一定差异，说明群体内具有丰富的遗传多样性，在遗传上仍具有较大的选育空间。为了避免近亲交配引起种质衰退，保证吉富罗非鱼快长优良性状的稳定遗传，也为了培育出生长速度更快的吉富罗非鱼品系，本研究把吉富尼罗罗非鱼中两个与机体生长调节密切相关的基因—生长激素促分泌素受体（Growth Hormone Secretagogue Receptor，GHSR）基因和和生长激素促分泌素（ghrelin）基因作为候选基因，通过基因克隆和序列多态性分析，初步获得其SNPs位点，再对SNPs基因型与吉富尼罗罗非鱼生长性状的关联性进行分析，拟从中找到吉富尼罗罗非鱼生长相关SNPs分子标记，将其应用于吉富尼罗罗非鱼的分子辅助育种过程中。本研究的结果如下：
　　1.尼罗罗非鱼GHSR基因和ghrelin基因的克隆及其多态性分析
　　克隆获得了尼罗罗非鱼GHSRⅠa和GHSRⅠb的cDNA序列，其中GHSRⅠa cDNA序列全长为4060bp，包括5′非编码区为1003bp、3′非编码区为1905bp、编码区为1152bp，该基因编码384个氨基酸；GHSRⅠb cDNA序列全长为4268bp，包括5′非编码区1003bp、3′非编码区2371bp和编码区894bp，共编码298个氨基酸。GHSRⅠa和GHSRⅠb氨基酸序列相似性为73.7％，它们位于N端的279个氨基酸完全相同。系统进化分析结果显示：尼罗罗非鱼GHSRⅠa和GHSRⅠb的氨基酸序列都与莫桑比克罗非鱼（O.mossambicus）和荷那龙罗非鱼（O.hornorum）中相应氨基酸序列的亲缘关系最近，与同属于丽鱼科的黑鲷（Sparus macrocephalus）聚为一大支，而与虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、建鲤（Cyprinus carpio var.Jian）及人类（Homo sapiens）中相应的氨基酸序列的亲缘关系较远。克隆获得了尼罗罗非鱼GHSR基因组DNA片段3206bp，包括5′非编码区1589 bp，3′非编码区231 bp和编码区1386 bp。编码区包括1个内含子和2个外显子，根据mRNA的两种不同剪接方式，分别编码384个（GHSRⅠa）和298（GHSRⅠb）个氨基酸。尼罗罗非鱼GHSR基因组序列与莫桑比克罗非鱼GHSR基因组序列（GenBank No:EU910220.1）相似性高达98.54%，与伯氏朴丽鱼(Haplochromisburtoni) GHSR基因组序列（GenBank No:XM_005926046.1）相似性为88.70%。从尼罗罗非鱼快长和基础群体中获得长度为2857bp的GHSR基因组DNA序列78条，共发现340个多态性位点（其中单核苷酸变异位点63个，简约性信息位点277个）和39种单倍型，核酸多样性（Pi）为0.0217，平均核苷酸差异数（K）为57.923，单倍型多样性（Hd）为0.00133；基础群体GHSR基因的单核苷酸多态性位点数（SNP）、单倍型数目（H）、核苷酸多样性（pi）、单倍型多样性（Hd）平均核苷酸差异数（K）等遗传参数的值都比快长群体中相应值要高，说明尼罗罗非鱼快长群体在选育的过程中导致该基因的遗传多样性降低。
　　从尼罗罗非鱼快长和基础群体中获得长度为841bp的ghrelin基因组DNA序列77条，共发现38个多态性位点（其中单核苷酸变异位点31个，简约性信息位点7个）和13种单倍型，平均核苷酸差异数（K）为2.7717，核酸多样性（Pi）为0.00402，单倍型多样性（Hd）为0.722；快长群体ghrelin基因中的单核苷酸变异位点数（S）比基础群体要少，而核苷酸多态性（Pi）和平均核苷酸差异数（K）要略高于基础群体，这是由于快长群体在选育的过程中近交几率大，多态性较低的单核苷酸变异位点因基因型纯化现象而消失，而多态性较高的单核苷酸变异位点得以保留，从而导致其平均核苷酸差异数和核苷酸多态性高于基础群体。
　　2.尼罗罗非鱼GHSR基因中生长相关SNP位点的筛选
　　从两个尼罗罗非鱼群体（快长群体和基础群体）的GHSR基因中共筛选到5个有效SNP位点S1(A-409G)、S2(G-424T)、S3(T-553A)、S4(T-1114A)和S5(A-1168C)，均分布于该基因5′侧翼区。SNP位点的基因型与两个尼罗罗非鱼群体子代生长性状之间的关联性分析结果显示：S4位点与平均核苷酸差异数（K）等遗传参数的值都比快长群体中相应值要高，说明尼罗罗非鱼快长群体在选育的过程中导致该基因的遗传多样性降低。5个SNPs位点组成了7种双倍型(D1-D7)，其中D3和D5双倍型个体的体重、体长、体高、头长、尾柄长、尾柄高等生长指标显著高于D4和D7双倍型个体(P<0.05)，而D1（体宽除外）、D2（体宽和尾柄长除外）和D6（体高除外）双倍型个体与其它双倍型个体之间在生长指标上均无显著差异(P>0.05)。尼罗罗非鱼快长群体子代和基础群体子代中的优势双倍型分别为D3双倍型（46.25%）和D4双倍型（35.44%）。以上结果表明，尼罗罗非鱼GHSR基因中S4位点处AA、AT基因型及双倍型D3、D5与快长性状密切相关，可作为尼罗罗非鱼分子标记辅助选育的候选标记。
　　3.尼罗罗非鱼ghrelin基因中生长相关SNP位点的筛选
　　从两个尼罗罗非鱼群体（快长群体和基础群体）的ghrelin基因中共筛选到3个有效SNPs位点（S1(A+134G)、S1(A+145G)和S1(A+155G)），均分布于该基因第1个内含子中，3个SNPs位点的遗传多样性参数、基因型和基因频率在同一群体中高度一致，SNP位点之间完全连锁。两个尼罗罗非鱼群体子代中3个SNPs位点处的优势基因型相同，但快长群体子代中优势基因型的频率要明显大于基础群体子代中相应基因型的频率。SNPs的基因型与两个尼罗罗非鱼群体子代生长性状的关联性分析结果表明，尼罗罗非鱼个体的多项生长指标（体重、体长、体高、头长和尾柄高等）在不同基因型中存在显著差异（S1:GG>AG,S2:TT>AT,S3:AA>AT;P<0.05）。D1双倍型（S1:GG,S2:TT,S3:AA）所对应的尼罗罗非鱼个体的多项生长指标（体重、体长、体高、头长和尾柄高等）要显著高于D2双倍型（S1:AG,S2:AT,S3:AT）。以上结果表明，尼罗罗非鱼ghrelin基因中3个SNP位点完全连锁，构成的D1双倍型与快长密切相关，可作为尼罗罗非鱼分子标记辅助选育的候选标记。

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引言

1 尼罗罗非鱼简介

2 鱼类生长相关基因ghrelin及其受体GHSR研究进展

3 分子标记在鱼类中的研究进展

4 本研究的目的与意义及技术路线

第一章 尼罗罗非鱼GHSR基因和ghrelin基因的克隆及多态性分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二章 尼罗罗非鱼GHSR基因SNPs位点的筛选及其与生长性状的关联性分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三章 尼罗罗非鱼ghrelin基因SNPs位点的筛选及与生长性状的关联性分析

1材料与方法

2结果

3讨论

全文总结

参考文献

附录 在读期间发表论文情况

致谢