半滑舌鳎LGR8基因克隆和CSW3基因的功能验证

摘要

LGR8是胰岛素样因子3(INSL-3)在体内的特异性受体，属于G蛋白偶联受体(GPCR)大家族。哺乳动物中LGR8高表达于睾丸引带等组织；在人类研究中发现编码LGR8和INSL-3的两个基因分别控制着哺乳动物雄性器官下降所必需的腹股沟韧带和索状引带的分化发育。目前一般认为，LGR8或INSL-3的突变有可能导致隐睾症的发生。本实验在对半滑舌鳎全基因组测序与转录组测序的基础上，通过RACE的方法克隆得到了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) LGR8基因全长，该基因全长为2768bp,共编码734个氨基酸。对其进行实时荧光定量PCR结果显示，在成熟性腺中，LGR8在雄性中主要在脑、性腺中表达；在雌鱼体内各组织中表达无显著差异，且雄鱼性腺和脑中的表达量要显著高于雌鱼；通过对不同时期的性腺进行实时荧光定量PCR结果显示，LGR8基因在鱼体发育80天左右表达量开始上升，150d～210d表达量达到最大，这表明LGR8在半滑舌鳎性别决定和性腺发育中起到一定的作用。
　　CSW3是本实验室在对半滑舌鳎基因组测序与转录组测序的基础上克隆得到的半滑舌鳎特有且在雌性性腺中高表达的基因，我们通过RACE技术克隆得到了半滑舌鳎CSW3基因cDNA全长。CSW3 cDNA基因全长为1714bp，其中5端非翻译区长173bp，3端非翻译区长929bp，编码区为612bp，编码共204个氨基酸。通过定量PCR实验结果表明，CSW3基因为组织广谱性表达，且在卵巢中表达最高。实验通过分析CSW3重组蛋白注射性腺后Dmrt1、Sox9、Amh、P450等性别决定相关基因的表达调控，探讨CSW3在半滑舌鳎性别决定与分化中的作用。重组蛋白注射半滑舌鳎性腺后实时定量PCR分析结果显示，Dmrt1、Sox9、Amh、P450等基因的表达量有不同程度的上调和下调，证明了CSW3蛋白具有一定的活性，可能一定程度上在性别决定中发挥重要作用。

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引言

第一章 综 述

1、 我国水产生物研究现状

2、 鱼类生殖研究

2.1鱼类性腺结构及类型

2.2鱼类性别决定机制

3 LGR8、CSW3基因的研究进展

3.1 LGR8基因的研究进展

3.2 CSW3基因的研究进展

4、本研究的目的和意义

第二章 LGR8基因的克隆及表达分析

1、实验材料与试剂

1.1实验材料

1.2实验试剂和器材

2试验方法

2.1基因组DNA的提取

2.2基因组RNA提取

2.3 RNA反转录

2.4 LGR8基因克隆

3结果

3.1 半滑舌鳎LGR8基因DNA序列及系统进化树

3.2 实时定量PCR结果

4分析与讨论

第三章 CSW3基因的功能验证

1、实验材料与试剂

1.1实验材料

1.2实验试剂和器材

2、试验方法

2.1 CSW3真核蛋白制备

2.2脂质体制备

2.3蛋白注射

2.4 DNA和RNA的提取以及切片制作

2.5 半定量分析

2.6 实时荧光定量PCR分析

3、结果

3. 1体长、体重、体宽分析结果

3.2组织切片观察结果

3.3定量及半定量结果

4讨论

论文小结

参考文献

致谢

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