人工催产花鳗鲡(Anguilla marmorata)卵巢发育过程中性类固醇激素含量影响

摘要

鳗鲡作为广泛分布的降海洄游类鱼类，其肉质鲜美，营养价值丰富，因而被大多数国家所喜爱，像日本就以喜食河鳗而闻名；但在目前关于鳗鲡的繁殖育种仍有很多未解之谜，本研究主要集中在鳗鲡（花鳗鲡和日本鳗鲡）人工繁殖过程中血液和性腺内类固醇激素的含量以及其变化。
　　性类固醇激素是动物体内性腺生长发育的必要激素，尤其对于硬骨鱼类人工繁殖过程中，睾酮(T)、孕酮(P)、雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、17α,20β-二羟基-4-孕烯-3-酮(DHP)、17α-羟基孕酮(17α-OHP)在性腺的发育前期、发育中期以及发育末期对卵细胞的卵黄形成以及胚泡破裂有重要作用。
　　对池塘养殖的花鳗鲡多次注射鲤鱼脑垂体（carp pituitary extract，20mg/kg·周）和人绒毛膜促性腺激素（hCG，300IU/kg·周）诱导花鳗鲡性腺发育以及成熟，采用贝克曼库尔特免疫分析仪通过化学发光免疫分析法（CLIA）研究此过程中，血清中游离类固醇类激素和糖蛋白类激素的变化，分析比较了不同成熟时期花鳗鲡血清中三种类固醇激素，即睾酮、孕酮、17β-雌二醇和三种糖蛋白类激素，卵泡刺激素（FSH）、黄体生成激素（LH）、人绒毛膜促性腺激素（hCG），在发育前期（注射激素第2针后，即第二周）；发育中期（注射激素第9针后，即第九周）；发育中后期（注射激素第13针后，即第十三周）；发育后期（注射激素第16针后即，第十六周）；发育末期（注射激素第20针后，即第二十周）激素的含量和变化。结果表明，激素注射组的性腺逐渐成熟，GSI显著升高；而对照组GSI未见增长，平均为(0.94±0.08)％；经过16-19次注射，卵细胞到达核偏移阶段，对此阶段的花鳗鲡注射17α-羟基孕酮（17α-Hydroxyprogesterone），可成功诱导花鳗鲡性腺成熟与排卵。与对照组相比，实验组中鳗鱼血清中的17β-雌二醇（E2）不断升高，尤其在性腺发育的中后期到后期阶段，显著升高；而孕酮（P）在发育后期升至最高，在发育后期至末期时显著降低；睾酮（T）在发育后期出现最高值。与对照组相比，实验组糖蛋白类激素--hCG在不同时期变化显著，尤其在发育末期到达最高值,分析其原因可能与催产针的注射有关；FSH与LH含量变化与孕酮相似。此外，研究发现激素注射12h、24h、72h小周期内，发育前期血清中孕酮的变化显著，12h时最高而后降低；发育中期血清中E2变化显著，注射激素24h时达到最高值。
　　性腺内的类固醇激素则采用采用超高效液相色谱—串联质谱（UPLC/MS/MS）方法。结果发现，睾酮、孕酮、雌二醇、雌三醇、17α，20β-二羟基-4-孕烯-3-酮、17α-羟基孕酮在xBridge C18色谱柱上得到良好分离，在0～200ng/ml的范围内线性相关系数均大于0.99，检测限为0.1～0.2ng/g，回收率超过了89％，相对标准差均小于7.3%；通过该方法表明，随着外源激素注射次数的增加，花鳗鲡卵巢中6种类固类醇激素的含量整体呈逐步增加的趋势，UPLC/MS/MS法能同时定量测定这6种性类固醇激素，具有灵敏、高回收率、稳定的优势。
　　河鳗人工繁殖采用鲤鱼脑垂体注射法，在发育末期，对不同发育状况（发育组、未发育组、难产组、自然产卵组）的雌性河鳗分析其性腺内的类固醇激素含量（睾酮、孕酮、雌二醇、雌三醇、17α，20β-二羟基-4-孕烯-3-酮、17α-羟基孕酮）；结果发现，雌二醇在未发育组中的检测结果与对照组一样，几乎检测不到；雌三醇的含量接近对照组，接近0.1ng/g；在难产组中DHP的含量显著增高，超过40ng/g；因此，通过本研究发现雌激素可能与鳗鱼的性腺发育启动有关系，当体内的雌二醇的含量很低时，人工繁殖的河鳗无论注射多少外源激素，可能都不会引起相应，分析其原因可能是形成雌激素的通路受阻；而DHP的含量过高可能会导致河鳗难产。
　　总之，本文集中研究了性类固醇激素在花鳗鲡发育不同时期的含量与变化，发现部分性类固醇激素是随着发育阶段的进行其含量的显著升高；对同一批河鳗的进行采用相同的方法进行人工繁殖，为何其效果差距如此大，主要原因是其性腺内性类固醇激素在含量上有很大差距，分析其可能对硬骨鱼类卵巢的发育有很重要的作用，尤其是在促进卵母细胞的生长与成熟方面；但本文并未对其转化的途径中关键因子酶进行深入研究，因此，此方面的研究有待继续。

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引言

第一章 文献综述

1.1 鳗鲡人工繁殖现状

1.2 日本鳗鲡（河鳗）的人工繁殖研究进展

1.3 鳗鲡人工繁殖过程中性腺的生长发育

1.4 河鳗人工催熟催产

1.5 性激素

第二章 花鳗鲡（Anguillamarmorata）人工繁殖过程中性腺发育

2.1 实验部分

2.2 实验方法以及样品处理

2.3 花鳗鲡的催熟以及催产

2.4 数据处理

2.5 结果与讨论

第三章 花鳗鲡人工繁殖过程中雌性鳗鱼血清中激素含量的变化

3.1 实验材料与方法

3.2 方法检测限与回收率

3.3 数据处理

3.4 结果与讨论

第四章 人工诱导花鳗鲡成熟过程中卵巢内6种性类固醇激素的含量及变化

4.1 试验与方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 结语

第五章 河鳗人工繁殖卵巢发育后期雌鱼性腺内激素含量的变化

5.1 材料与方法

5.2 样品分析

5.3 数据处理

5.4 结果与讨论

展望

结论

参考文献

致谢