泥蚶Smad1/5、BMP2/4基因的克隆、表达分析及生长性状相关SNP位点筛选

摘要

泥蚶（Tegillarca granosa）是我国四大传统养殖贝类之一，具有较高的营养价值和药用价值，深受沿海地区居民的喜爱。但是目前，对包括泥蚶在内的软体动物的生长调控机制尚不清楚，进而制约了高效率的快速生长性状定向培育优良品种的分子标记辅助育种技术研发进程。转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)超家族是一组结构相关性的多功能细胞因子，在细胞增殖、分化和生长等生物学过程中发挥重要作用。该超家族中具有众多生长相关功能基因，本研究就对其中的Smad1/5基因和BMP2/4基因在泥蚶中的作用机制展开了探究，以期为泥蚶分子标记辅助育种（molecular marker-assisted selection，MAS）提供理论基础，使育种更具针对性，缩短泥蚶育种周期，降低育种成本，改进传统选育技术，大力发展泥蚶健康养殖产业。研究结果如下：
　　1.获得Smad1/5基因的cDNA全长、基因组结构及其时空表达特征。利用RACE方法克隆得到泥蚶Smad1/5基因（Tg-Smad1/5）的cDNA全长序列（GenBank登录号：KP250873），该序列全长2424bp，开放阅读框（open reading frame，ORF）有1386bp，编码462个氨基酸。Tg-Smad1/5蛋白与双壳贝类中合浦珠母贝（Pinctada fucata）、太平洋牡蛎（Crassostreagigas）的同源性分别达到了92.3％、91.2%。在cDNA序列基础上，利用普通PCR方法克隆获得了Tg-Smad1/5基因的3个内含子，大小分别为504bp，553bp，874bp，均属于GT-AG-内含子。利用染色体步移（genome walking）技术克隆得到泥蚶Smad1/5基因启动子序列，该片段长从5’末端到起始密码子ATG的长度为934bp，包含GATA框、八聚体转录因子（Oct-1）等结构，符合启动子序列特征。利用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quanititative PCR，qRT-PCR）技术，研究了Smad1/5基因在泥蚶6个组织和9个发育时期中的表达情况，结果显示，Tg-Smad1/5基因在泥蚶成贝6个组织中均有表达，而在斧足中的表达量最高，极显著地高于其他组织；在各发育时期中，Tg-Smad1/5表达量随发育进程呈逐渐升高的趋势，在眼点幼虫期达到最高，极显著高于其他时期，而在变态至稚贝时，表达量又极显著地下降。研究结果表明，Tg-Smad1/5具有类似于高等动物的分子结构，并在泥蚶不同组织、不同发育时期表达有所差异，这为进一步研究该基因在贝类中的功能和作用机制奠定了重要基础。
　　2. BMP2/4基因的扩增及其时空表达特征的研究。利用 SMART RACE技术克隆泥蚶BMP2/4基因（Tg-BMP2/4）的cDNA全长，最终得到1583bp的cDNA片段，开放阅读框有896bp，编码298个氨基酸。Tg-BMP2/4与其他物种的同源性不高，与同是贝类的太平洋牡蛎、栉孔扇贝同源性也仅有53%和52%。运用qRT-PCR技术对Tg-BMP2/4基因的时空表达进行分析。结果显示，Tg-BMP2/4基因在泥蚶成贝6个组织中均有表达，而在鳃、外套膜和斧足中的表达量都较高，极显著地高于血液、闭壳肌和内脏团组织；在各发育时期中，Tg-BMP2/4表达量在眼D形幼虫和稚贝时期较高，稚贝时则达到最高值，极显著高于其他时期。本研究结果表明，Tg-BMP2/4在泥蚶不同组织、不同发育时期表达差异显著，其可能参与泥蚶的器官组织发生和壳的生长。这为进一步研究BMP2/4基因在贝类中的功能和作用机制奠定了重要基础。
　　3. Smad1/5基因与生长性状相关SNP位点的筛选。随机选取10个泥蚶个体，通过对已知序列进行直接测序，获得候选SNP位点78个。SNP密度为平均每1SNP/43bp，其中外显子区域密度为1SNP/198bp，内含子区域密度为1SNP/28bp。位点突变类型比例分别为：转换34.62%，颠换28.21%，插入/缺失37.18%。编码区的7个SNP均为转换类型且包括5个同义突变和2个非同义突变。利用HRM技术，在一群体82个泥蚶个体中验证到，第一段内含子中筛选获得的SNP c.74G>A位点与生长性状相关，GG型个体壳长、壳宽、壳高、壳重、软体重5项生长指标均显著高于AA型（P<0.05），也高于杂合型GA型个体。可将该研究结果运用到实际育种中，但中间还有很多工作要展开，还需更加深入的研究和拓展。

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引言

第一章 文献综述

1.1泥蚶功能基因的研究现状

1.2 Smad蛋白及其在贝类中的研究进展

1.3 BMP家族基因的研究进展

1.4基因的单核苷酸多态性及其应用

1.5本研究的目的和意义

第二章 Tg-Smad1/5基因cDNA全长的克隆、基因组结构及时空表达分析

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3结果

2.4讨论

第三章 Tg-BMP2/4基因cDNA全长的克隆和时空表达分析

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3结果

3.4讨论

第四章 Tg-Smad1/5基因SNPs筛选及其与生长性状的关联分析

4.1实验材料

4.2实验方法

4.3结果

4.4讨论

第五章 结论

参考文献

硕士在读期间参与的课题及发表的论文

致谢