条纹锯鮨在性逆转过程中的组织生理学变化和相关基因的克隆及表达特征分析

摘要

条纹锯鮨（Centropristis striata）是一种名贵的海水养殖鱼类，肉质丰腴、味道鲜美，深受消费者的青睐。目前由于人工繁育中常常存在雄性亲鱼高龄化、雌雄生殖不同步和雄鱼缺乏等现象，很大程度上限制了条纹锯鮨人工繁育工作的进行。因此，探明条纹锯鮨性逆转的机理，利用人工方法提早使雌鱼转雄，是大规模人工繁殖的关键。本研究通过外源埋置的方法诱导条纹锯鮨性别转化，得到功能性的雄鱼，同时使用组织学、生理学、分子生物学的方法对诱导的效果进行分析，旨在为大批量人工苗种生产研究提供理论参考。 1、条纹锯鮨性逆转过程中的组织学及生理学变化 为探讨条纹锯鮨性逆转过程中内分泌调节机理，本文采用药条埋置的方法，将17α-甲基睾酮（17α-MT）和芳香化酶抑制剂药条单独和混合埋置到1+龄条纹锯鮨肌肉中，观察并分析性别转换过程中其组织学特征和生理学变化。结果显示，实验结束后，实验组条纹锯鮨已转化为功能性雄鱼，并获得有活力的精子，而对照组仅有少数个体转雄。（1）实验组条纹锯鮨性腺成熟系数先降低后升高，而对照组则变化不显著。随着埋置药条次数增加实验组鱼外观呈出明显的婚姻色，并可以看到头部的脂肪突起，解剖后性腺已由黄色囊状转变为乳白色，而对照组鱼体大部分呈明亮的黑灰色，少数个体性腺呈白色。性别转换过程中条纹锯鮨性腺发育过程主要分四个阶段：卵巢发育期，雌雄共存雌性占优期，雌雄共存雄性占优期，精巢发育期。（2）埋置药条后，17α-MT组条纹锯鮨血清性类固醇激素睾酮（T）显著升高并维持在较高水平，雌二醇（E2）水平明显下降，而脑内芳香化酶的活性与对照组差别不明显；芳香化酶抑制剂组血清雌二醇的水平明显降低的同时，T水平相对对照组升高显著，同时脑内芳香化酶活性与对照组相比变化不大；而芳香化酶抑制剂和17α-MT结合使用组鱼体血清中T水平高于两者单独使用组，E2的水平也远低于其他两组。（3）芳香化酶抑制剂和17α-MT结合使用诱导条纹锯鮨产生精子的活力和寿命要优于两者单独使用组。 2、条纹锯鮨Dmrt1和Foxl2的基因克隆及组织表达分析 为了研究Dmrt1基因和Foxl2基因在条纹锯鮨性腺分化中的功能，本研究采用同源克隆及RACE克隆的方法，克隆出Dmrt1基因和Foxl2基因全长cDNA序列。Dmrt1基因序列全长1426bp，开放阅读框(ORF)903bp，编码300个氨基酸，氨基酸序列中包含一个特有的DM结构域；Foxl2基因序列全长1985bp，开放阅读框(ORF)918bp，编码306个氨基酸，氨基酸序列中包含一个特有的forkhead（FH）结构域。qRT-PCR检测结果表明Dmrt1仅在精巢中表达，在其他各组织中几乎不表达。在雌鱼成体各组织中，Foxl2基因在脑、垂体、性腺、鳃中表达量较高，在其他组织中表达量较低；在雄鱼成体各组织中，Foxl2基因在脑、垂体、鳃中表达量较高，在精巢中也有少量表达，在其他组织中表达量较低。 3、条纹锯鮨Dmrt1和Foxl2的基因在性逆转过程中的表达分析 RT-qPCR检测结果表明，埋置含有17α-甲基睾酮与芳香化酶抑制剂的药条后，在由雌转雄的过程中，埋置组和对照组性腺中Dmrt1基因的表达都呈现不同程度的上调趋势，与对照组相比，埋置组Dmrt1基因表达的上调趋势更加显著（P＜0.05）；埋置组和对照组性腺中Foxl2基因的表达都呈现不同程度的下调趋势，与对照组相比，埋置组Foxl2基因表达的下调趋势更加显著（P＜0.05）。

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引言

第一章 文献综述

1 石斑鱼繁殖生物学

2 石斑鱼性逆转的诱导及调控机理

3 性别决定与性别分化的分子基础

第二章 17α-甲基睾酮及芳香化酶抑制剂对条纹锯鮨性逆转的影响

1 材料方法

2 结果

3 讨论

第三章 Dmrt1基因的克隆及表达分析

1实验材料与试剂

2 实验方法

1 实验结果

4 讨论

第四章Foxl2基因的克隆及表达分析

1 实验材料与试剂

2 实验方法

3实验结果

4 讨论

结论

参考文献

附录

致谢