副溶血性弧菌胞外蛋白的鉴定及一种新型分泌蛋白(VPChn25_1440)功能的研究

摘要

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种重要的食源性致病菌，已成为我国沿海地区微生物性食物中毒事件的首要风险因子。该菌主要通过分泌胞外蛋白和毒性因子于胞外环境或者直接注入宿主靶细胞内使宿主致病。本研究以分离自四种常见虾类水产样品中的400株副溶血性弧菌为研究对象，对其毒性、抗生素抗性、重金属耐受性以及进化起源关系进行了分析。运用分泌组学、转录组学、生物信息学、细胞生物学，以及分子生物学技术和方法，首次系统研究了毒性与非毒性副溶血性弧菌菌株胞外分泌蛋白的异同，发现、鉴定、获得了多种功能未知的分泌蛋白以及副溶血性弧菌潜在致病因子。本研究还运用基因敲除技术，构建获得了其中一种新型分泌蛋白（VPChn25_1440）编码基因的缺失突变株，并对其生物学功能进行了探索。主要研究结果如下： 分离自凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）、斑节对虾（Penaeus monodon）和脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）中的400株副溶血性弧菌分离菌株携带两种主要毒性蛋白耐热直接溶血素（Thermostable direct hemolysin，TDH）和TDH-相关溶血素（TDH-related hemolysin，TRH）编码基因tdh和trh的检出率分别为0%和0.5%，对氨苄西林（Ampicillin）的抗性率最高（99.0%），其次为链霉素（Streptomycin）（45.3%）和利福平（Rifampicin）（38.3%）；约15.3%的受试菌株具有多药抗性（Multidrug resistance，MDR）表型。其中90株具有三种及三种以上抗生素抗性的受试菌株对重金属铬（Cr3+）和锌（Zn2+）均具有耐受性；约93.3%、87.8%和73.3%的受试菌株对铜（Cu2+）、铅（Pb2+）和镉（Cd2+）也具有较高耐受性；其基因组指纹图谱分属71个NotI-PFGE（Pulsed-field gel electrophoresis）脉冲型（pulsotypes），相似度为65-100%，表明受试副溶血性弧菌分离株高度的基因组变异。 获得、比较毒性与非毒性副溶血性弧菌差异显著的分泌组图谱，发现、鉴定、解析了毒性ATCC33847（tdh+trh-）和非毒性CHN289（tdh-trh-）菌株间21种差异分泌蛋白。其中19种为毒性ATCC33847菌株所独有，68.8%的分泌蛋白与该菌株的毒性及环境适应性相关，包括：触发因子（Trigger factor）、分子伴侣SurA（Chaperone SurA）、丙氨酸脱氢酶（Alanine dehydrogenase）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、外膜蛋白OmpV（Outer membraneprotein OmpV）、分子伴侣Skp（Chaperone proteinSkp）、天冬氨酸半醛脱氢酶（Aspartate-semialdehyde dehydrogenase）、黄素氧化还原蛋白[4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase(flavodoxin)]、谷氨酸激酶（Glutamate5-kinase）、核糖体相关抑制子A（Ribosome-associated inhibitor A）和通用应激蛋白（Universalstress protein）。其它分泌蛋白参与细胞蛋白合成与代谢，包括色氨酸-tRNA连接酶（Tryptophan-tRNA ligase）、3-酰基-酰基载体蛋白还原酶（3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] reductase）和50S核糖体蛋白L10（50S ribosomal protein L10）。非毒性CHN289菌株独有2种分泌蛋白，分别是氨基酸ABC转运底物结合蛋白（Amino acid ABC transporter substrate-binding protein）和功能未知的 vps289-2。另外，本研究还发现、鉴定、解析了毒性ATCC17802（tdh-trh+）和非毒性CHN214（tdh-trh-）菌株之间28种差异分泌蛋白。其中26种为毒性ATCC17802菌株独有，2种为非毒性CHN214菌株独有。此外，毒性与非毒性副溶血性弧菌比较分泌组分析还揭示了多种具有潜在致病性，迄今为止鲜有研究报道的分泌蛋白，例如，触发因子、天冬氨酸半醛脱氢酶、黄素氧化还原蛋白、谷氨酸激酶、色氨酸-tRNA连接酶、3-酰基-酰基载体蛋白还原酶、核糖体相关抑制子A和通用应激蛋白。 获得、比较七株副溶血性弧菌的分泌组图谱，发现、鉴定、解析了毒性和非毒性菌株间14种共有分泌蛋白，其中约50%参与蛋白质合成和糖类运输。意外发现六种胞外蛋白可能与副溶血性弧菌致病性相关，包括：翻译延伸因子EF-Tu（Translation elongation factor EF-Tu）、5'磷酸吡哆醇合成酶（Pyridoxine5'-phosphate synthase）、σ54调节蛋白（σ54modulation protein）、二氢硫辛酸脱氢酶（Dihydrolipoyl dehydrogenase）、转醛醇酶（Transaldolase）和磷酸甘油酸酯激酶（Phosphoglycerate kinase）。此外，本研究的比较分泌组分析还揭示了迄今为止在其它任何细菌中均未有研究报道的四种分泌蛋白：核糖体循环因子（Ribosome-recycling factor）、翻译延伸因子EF-Ts（Translation elongation factor EF-Ts）、磷酸载体蛋白HPr（Phosphocarrier protein HPr）和麦芽结合蛋白MalE（Maltose-binding protein MalE）。 构建、鉴定、获得了副溶血性弧菌 CHN25菌株功能未知的胞外分泌蛋白vps10基因编码 chn25_1440的缺失突变株△chn25_1440，以及回复突变株△chn25_1440+Com。研究发现，chn25_1440基因缺失可能增强了副溶血性弧菌的酸耐受性，但是降低了该菌的运动性和生物被膜形成能力。此外，chn25_1440基因不贡献该菌对子宫颈癌细胞株（Hela）和结肠腺癌细胞株（CaCo-2）的细胞毒性，但是参与该菌诱导的靶细胞调亡以及细胞黏附作用。 副溶血性弧菌CHN25野生型和△chn25_1440突变型菌株的转录组分析结果显示，chn25_1440基因缺失诱导了基因组227（4.89%）个基因的差异表达（q-value≤0.05且 Fold-change≥2）。其中表达上调基因占差异表达基因的70.9%。△chn25_1440突变株中支链氨基酸代谢（valine，leucine and isoleucine degradation）、硫代谢（sulfur metabolism）、硒代谢（selenocompound metabolism）、单环β-内酰胺的合成（monobactam biosynthesis）、香叶醇代谢（geraniol degradation）、酮体的合成与降解（synthesis and degradation of ketone bodies）、磷酸转移酶系统（phosphotransferase system）、丁酸代谢（butanoate metabolism）、丙酸代谢（propanoate metabolism）、环境应激代谢（microbial metabolism in diverse environments）、果糖和甘露糖代谢（fructose and mannose metabolism）、赖氨酸代谢（lysine degradation）以及β-丙氨酸代谢（beta-alanine metabolism）途径发生显著变化，差异表达基因占55.6-100%。上述结果表明，chn25_1440基因缺失可能影响菌株细胞膜结构和能量代谢导致其运动能力及生物被膜形成能力下降。 综上所述，本研究结果为水产食品的安全风险评估、副溶血性弧菌致病机制的阐释，以及食源性致病菌新型候选疫苗的筛选提供了理论依据或数据支撑。

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第一章 绪论

1.1 副溶血性弧菌概述

1.2 副溶血性弧菌毒性相关因子

1.3 研究目的及意义

第二章 副溶血性弧菌分离菌株毒力相关基因、抗生素抗性、重金属耐受性及进化起源关系的研究

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第三章 毒性与非毒性副溶血性弧菌比较分泌组学的研究（I）

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 毒性与非毒性副溶血性弧菌比较分泌组学的研究（II）

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第五章 副溶血性弧菌CHN25编码未知功能分泌蛋白VPChn25_1440基因的缺失突变株及回复突变株的构建

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 结果与讨论

5.4 本章小结

第六章 chn25_1440基因缺失对副溶血性弧菌CHN25环境适应性及宿主细胞侵染能力影响的分析

6.1 实验材料

6.2 实验方法

6.3 结果与讨论

6.4 本章小结

第七章 chn25_1440基因缺失对副溶血性弧菌CHN25 全基因组基因表达的影响

7.1 实验材料

7.2 实验方法

7.3 结果与讨论

7.4 本章小结

第八章 结论与展望

8.1 主要结论

8.2 展望

参考文献

附录

致谢

攻读博士期间发表的相关论文与工作成果