刺参大水面养殖系统中菌群、藻相结构的季节变化与益生菌的初步筛选

摘要

进入21世纪，随着人民生活水平的提高和需求量的日益增加，刺参的需求量不断增大，刺参养殖业迅猛发展。利用近海海域养殖刺参逐渐兴起，随之出现了刺参大水面养殖，以及刺参与海蜇混养等新的养殖模式。本文主要研究了刺参大水面养殖系统中四季水质指标的变化，并采用传统细菌培养和高通量测序技术分析了养殖环境中微生态结构的四季变化，对比分析了参-蛰混养对池塘水质、菌群结构以及真核生物的影响。同时，对培养分离的细菌进行拮抗病原菌实验，筛选分离具有拮抗病原菌的益生菌株。为刺参大水面健康养殖提供理论基础。 1、刺参大水面养殖池塘水质、菌群结构以及真核生物的变化规律 2014年12月～2015年12月对刺参大水面养殖池塘水质指标、菌群结构以及真核生物进行了研究。结果显示：四季水温变化范围为0.23～27.77℃之间，盐度保持在30左右，pH在7.5左右，叶绿素a的含量在0.4～2.5μg/L，COD含量在0.58～0.96 mg/L，NO2-N含量在8.43～15.95μg/L，NH4-N含量在17.16～37.19μg/L，NO3-N含量在6.89～154.94μg/L，无机氮含量在41.58～191.28μg/L，PO4-P含量在5.93～25.68μg/L。水体中细菌总数含量在8×103～3×103cfu/mL之间，弧菌的数量在6.4×102～3.4×102cfu/mL，底泥细菌总数数量在3.6×104～8.0×103cfu/g，底泥中弧菌数量在5.1×103～1.5×103 cfu/g。在春季和冬季水体和底泥中弧菌比例相对较高。通过高通量测序结果显示各样品在门水平上最大相对丰度排名前十的物种主要有变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌(Actinobatceria)、泉古菌门(Crenarchaeota)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝菌门(Cyanobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、酸杆菌门(Acidobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、绿弯菌门(Chloroflexi)等。厚壁菌门(Firmicutes)在各样品种的比例相差较大。在夏季水体和底泥样品种含量都很少，在冬季水体和底泥中含量较高。拟杆菌门(Bacteroidetes)在水体和底泥中随着春、夏、秋、冬季节的变化比例在逐渐减小。通过传统方法对水体中的微型藻类进行调查分析显示水体中的微型藻主要以硅藻为主，春季和秋季微藻的含量较高，在不同季节藻类的优势度有很大差异，在春季中肋骨条藻、派格棍形藻、扭链角毛藻为优势种群，夏季菱形藻、羽纹藻、中肋骨条藻、派格棍形藻占优势地位，秋季羽纹藻、派格菱形藻和舟形藻占优势地位，冬季以羽纹硅藻和派格棍形藻占优势地位。通过18s rDNA测序分析结果显示真核生物排名前10的主要有担子菌门（Basidiomycota）、硅藻门（Diatomea）、有孔虫门（Cercozoa）、囊泡虫总门（Alveolata）、绿藻门（Chlorophyta）、纤毛虫门（Ciliophora）、软体动物门（Mollusca）环节动物门（Annelida）等。通过样品多样性分析显示春季、夏季和秋季底泥真核生物的多样性大于水体中真核生物多样性，冬季水体中真核生物的多样性大于底泥真核生物多样性。 2、参蛰混养对水体水质指标、菌群结构以及真核生物的影响 通过测定混养池塘和非混养池塘八月和十月水质指标。结果显示：混养对水质指标有显著影响，混养池塘 COD的含量显著高于非混养池塘，混养对水体氨氮，硝酸氮，无机氮的影响较小。利用高通量测序显示混养池塘水体和底泥中的菌群多样性显著高于非混养池塘，混养池塘水体中真核生物多样性高于非混养池塘，结果说明刺参池塘混养海蜇对水质指标，菌群结构和真核生物都有显著影响。 3、刺参大水面养殖池塘潜在益生菌的初步筛选 以刺参“腐皮综合征”主要病原菌—灿烂弧菌（Vibrio splendidus）和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为指示菌进行拮抗作用实验，利用选择培养基对菌株产淀粉酶和蛋白酶的能力进行测定，最后通过安全性试验得到潜在益生菌株YQ-2。结果表明：该菌株对灿烂弧菌和假交替单胞菌有较强的抑制作用，抑菌圈分别达到22mm和24mm；对淀粉和蛋白选择培养基水解圈的直径达到22mm和36mm。安全性试验显示：该菌株无论是在108cfu/mL浸浴还是投喂108cfu/g的粉末饲料感染，一个月时间内供试刺参没有发病和死亡现象，健康程度好，且相对于对照组的体重明显增长，108cfu/g粉末饲料投喂组的相对增长率达到39.31%。此外，本文对YQ-2菌株的生理生化指标、16s rDNA序列进行了分析，其同源性与Bacillus subtilisstrain KLP2015相似度达到99%，故此将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。

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引言

第一章 文献综述

1.1刺参池塘养殖的发展现状和问题

1.2刺参大水面养殖的发展现状及前景

1.3 刺参池塘养殖系统菌群结构的研究

1.4 刺参养殖池塘真核生物及微藻的研究

1.5 参蛰混养的发展现状和存在的问题

1.6刺参养殖池塘益生菌的筛选

第二章 刺参大水面养殖系统中水质因子与菌群结构的季节变化

2.1前言

2.2材料和方法

2.3试验结果

2.4分析与讨论

第三章 刺参大水面养殖系统中真核生物的季节变化

3.1前言

3.2材料和方法

3.3结果

3.4讨论

第四章 参蜇混养池塘水质因子与微生态结构分析

4.1前言

4.2材料和方法

4.3结果

4.4讨论

第五章 刺参大水面养殖池塘环境中益生菌筛选及其特性分析

5.1前言

5.2材料和方法

5.3结果

5.4讨论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文