合浦珠母贝几丁质酶基因与章鱼胺受体基因的克隆、表达与功能分析

摘要

合浦珠母贝(Pinctada fucata)，是我国海水珍珠养殖的主要贝类，著名“南珠”即为其所产。近年来，由于养殖环境恶化、疾病虫害以及种质退化等原因导致合浦珠母贝珍珠产量及质量下降。几丁质是贝壳形成的的三大重要成分之一，而几丁质酶又是几丁质的调控蛋白。章鱼胺受体广泛存在于无脊椎动物中，具有调节神经肌源性节奏收缩、调节 cAMP水平、参与磷酸化途径等多种重要功能。为探究几丁质酶基因与章鱼胺受体基因在合浦珠母贝生长发育及贝壳形成过程中的作用，本研究根据合浦珠母贝的高通量测序获得的转录组数据，克隆了合浦珠母贝几丁质酶-1基因与章鱼胺受体基因，并通过不同组织的表达分析、不同发育时期的表达分析、破壳诱导表达分析和原位杂交实验推测了这两个基因的表达特性及生理功能。初步探讨了它们在合浦珠母贝生长、发育以及贝壳修复过程中的作用，为进一步开展合浦珠母贝的繁育与育珠工作提供了理论基础。研究结果如下： 1.合浦珠母贝Pf-Chi1基因的克隆与表达分析 本研究根据合浦珠母贝的转录组数据，筛选到一个几丁质酶基因片段，通过5’-RACE和3’-RACE技术得到了合浦珠母贝几丁质酶-1基因的cDNA全长，命名为 Pf-Chi1（GenBank登录号：KT956975）。Pf-Chi1基因 cDNA序列全长为2743bp，5'非翻译区（5'-UTR）为47bp，开放阅读框为2187bp，3'非翻译区（3'-UTR）为509bp，具有一个加尾信号（AATAAA）。该基因编码728个氨基酸，蛋白的预测分子量为78.41kDa,理论等电点（PI）为5.57，包含一个长度为19个氨基酸的信号肽。功能结构域预测发现该蛋白具有4个保守结构域：1个N端催化结构域（GH18糖水解结构域）和3个几丁质结合结构域（CBM14结构域）；几丁质酶-1氨基酸序列比对结果显示，Pf-Chi1与其他物种Chi1具有同源性，相似度为22.43-31.4%，其中与太平洋牡蛎的相似性最高为31.4%；系统进化树结果显示，Pf-Chi1归类于双壳纲且与太平洋牡蛎Chi1聚为一支，说明Pf-Chi1属于双壳纲Chi1家族。 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析结果显示，Pf-Chi1 mRNA在合浦珠母贝的外套膜、闭壳肌、鳃、肝胰腺、血液、肠和性腺中均有表达，并且在外套膜中的表达量最高，在肠中表达量最低。在合浦珠母贝幼虫不同发育时期的表达分析结果显示，Pf-Chi1 mRNA在担轮期、D型期、壳顶期、眼点期和变态期5个时期中均有表达，且在担轮期幼虫的表达量极显著的高于其他4个时期。上述结果表明Pf-Chi1基因可能在合浦珠母贝的生长发育、贝壳形成和幼虫的变态发育阶段起着重要作用。 利用实时荧光定量PCR技术检测Pf-Chi1基因在破壳后0h、6h、12h、24h、36h和48h6个不同时间段在外套膜中的表达情况。破壳诱导表达qRT-PCR分析结果显示，Pf-Chi1 mRNA的表达量在破壳后先逐渐降低，在24h时显著增加( p<0.05)，随后逐渐降低到正常水平。上述结果表明，Pf-Chi1基因可能在合浦珠母贝贝壳的生长与修复过程中起重要作用。 外套膜组织原位杂交实验结果显示，Pf-Chi1基因在外套膜边缘内褶的外表皮细胞有较强的杂交信号出现，内褶的内表皮细胞与中褶的内表皮细胞有少量杂交信号出现，阴性对照没有杂交信号出现。以上结果表明Pf-Chi1基因可能在合浦珠母贝的贝壳形成与修复过程中起重要的作用。 2.合浦珠母贝PfOAR基因的克隆与表达分析 本研究克隆获得了合浦珠母贝章鱼胺受体基因的cDNA全长，命名为PfOAR（GenBank登录号：KX082720）。PfOAR基因cDNA序列全长为1890bp，5'非翻译区（5'-UTR）为113bp，开放阅读框为1659bp，3'非翻译区（3'-UTR）为118bp。该基因编码552个氨基酸，蛋白的预测分子量为63.167kDa,理论等电点（PI）为9.19。功能结构域预测发现该蛋白具有7个跨膜结构域，具有G蛋白偶联受体的共性。氨基酸序列比对结果显示，PfOAR与其他物种OAR蛋白具有较高的同源性；系统进化树结果显示，PfOAR与太平洋牡蛎OAR聚为一支。 qRT-PCR检测结果显示，PfOAR mRNA在合浦珠母贝的外套膜、珍珠囊、肠、肝胰腺、鳃和闭壳肌中均有表达，并且在外套膜中的表达量最高。在合浦珠母贝幼虫不同发育时期的表达分析结果显示，PfOAR mRNA在担轮期、D型期、壳顶期、眼点期和变态期5个时期中均有表达，且在变态期幼虫的表达量显著的高于其他4个时期。上述结果表明PfOAR基因可能在合浦珠母贝的生长发育、贝壳形成和幼虫的变态发育阶段起重要作用。 利用qRT-PCR技术检测PfOAR基因在破壳后0h、6h、12h、24h、36h和48h6个不同时间段在外套膜中的表达情况。破壳诱导表达 qRT-PCR的分析结果显示，PfOARmRNA的表达量在破壳后的第36h显著升高( p<0.05)。上述结果表明，PfOAR基因可能在合浦珠母贝贝壳的生长与修复过程中起重要作用。

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引言

第一章 文献综述

1.1 合浦珠母贝研究概况

1.1.1 合浦珠母贝简介

1.1.2 合浦珠母贝的贝壳结构

1.1.3 合浦珠母贝的矿化器官——外套膜

1.1.4 合浦珠母贝的研究现状

1.2 几丁质和几丁质酶的研究概况

1.2.1 几丁质简介及研究概况

1.2.2 几丁质酶简介及研究概况

1.3 章鱼胺及章鱼胺受体的研究概况

1.4 本研究的目的、意义和技术路线

1.4.1 研究目的

1.4.2 研究意义

1.4.3 技术路线

第二章 合浦珠母贝Pf-Chi1基因与PfOAR基因的克隆及分子特征

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验试剂与耗材

2.1.3 主要仪器设备

2.1.4 主要溶液、培养基及缓冲液的配制

2.1.5 合浦珠母贝外套膜总RNA提取

2.1.6 引物设计与合成

2.1.7 cDNA全长的克隆

2.1.8 生物信息学分析

2.2 结果与分析

2.2.1 合浦珠母贝外套膜总RNA的提取

2.2.2 合浦珠母贝Pf-Chi1基因的克隆及分子特征

2.2.3 合浦珠母贝PfOAR基因的克隆及分子特征

2.3 讨论

2.3.1 合浦珠母贝Pf-Chi1基因

2.3.2 合浦珠母贝PfOAR基因

第三章 合浦珠母贝Pf-Chi1基因与PfOAR基因的表达分析及功能研究

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 主要工具和试剂

3.1.3 不同组织以及不同发育时期的实时荧光定量PCR表达分析

3.1.4 合浦珠母贝Pf-Chi1基因与PfOAR基因的破壳诱导表达

3.1.5 原位杂交

3.2 结果与分析

3.2.1 合浦珠母贝Pf-Chi1基因与PfOAR基因在不同组织和不同发育时期的荧光定量表达分析

3.2.2 合浦珠母贝Pf-Chi1基因与PfOAR基因破壳后荧光定量表达分析

3.2.3 合浦珠母贝Pf-Chi1基因原位杂交结果分析

3.3 讨论

第四章 结论

参考文献

附录1 缩略词表

附录2 硕士期间发表的文章和参加的会议

致谢