水产养殖源哈维氏弧菌的流行特征与致病性差异分析

摘要

哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）是多种水产养殖动物的一种主要的病原弧菌，广泛分布于养殖海水和水产动物的体内外。近年来，哈维氏弧菌造成的弧菌病频繁暴发，严重的影响了我国水产养殖业的发展。研究表明，目前已报道的哈维氏弧菌可以感染鲷鱼、南美白对虾、鲈鱼和杂色鲍等鱼、虾和贝类等重要水产经济动物。由于对该病的认识时间不够，其流行病学及致病机理的研究尚处于探索阶段，尤其是目前国内缺乏对哈维氏弧菌菌株间分子型分析的研究，以致于对于该哈维氏弧菌病源头的防控工作缺乏基础的理论知识。本实验采集了福建省、江苏省、浙江省和海南省四个地区的患病水产养殖动物，通过多种鉴定方法得到了57株哈维氏弧菌；并运用脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型方法对所有的哈维氏弧菌菌株进行分型研究，以及对10株特征性哈维氏弧菌菌株进行了致病性和生物学特性的比较，包括人工实验感染、药物敏感性、生化特性鉴定、毒力相关基因的检测和强弱毒株的胞外蛋白差异。主要结果如下： 1、PFGE分型结果：57株分离自不同地区不同养殖动物的哈维氏弧菌，54株可分型，经过 PFGE分型方法得到了很好的分离，菌株 PFGE相似度范围约36%-100%，共分出了38个不同的谱型。不同地区谱型的种类一般不同，除了江苏和海南两省分别分出了11个谱型外，浙江省有7个谱型，福建省有8个谱型。同一地区存在1-4种占优势的谱型，其中，浙江省有3个优势谱型，江苏省有2个优势谱型，海南省有1个优势谱型，而福建省优势谱型最多，共有4个。总体来看，一般来自同一地区的哈维氏弧菌菌株存在相对比较近的亲缘关系，不同地区的哈维氏弧菌菌株一般差异较大，并且各地区菌株分属多个谱型，图谱较分散，说明目前哈维氏弧菌一般仅在各地区流行多个克隆种类，不同地区之间哈维氏弧菌流行范围不大。但个别不同地区来源的菌株同源性较高，提示可能有相同的传染源。 2、根据采集样品时动物的发病特征，本研究从发病的出现红体症状的凡纳滨对虾分离到了10株哈维氏弧菌，对这些菌株的致病性以及一般生物学特性开展了对比研究，其结果如下： （1）用哈维氏弧菌对凡纳滨对虾进行了致病性实验，结果显示在观察期（5天）内，感染组对虾出现不同程度的红体和死亡现象。注射菌液1天后感染组对虾死亡30%，2天后死亡60%，到第4天，死亡率达到了100%。而对照组对虾摄食良好，没有出现发病特征和死亡现象。并且发现菌株 Vh00947、Vh11011、Vh21217、Vh21220、Vh21231和Vh31487的致病性很强，攻毒弧菌数小于1000 CFU/尾即可导致观察期内被感染对虾死亡50%以上；Vh11014和Vh21218致病性较强，攻毒弧菌数小于10000CFU/尾可导致观察期内被感染对虾死亡50%以上；而Vh00949和Vh21229的致病性较弱。 （2）药物敏感实验结果显示，所有分离菌株都对环丙沙星、氯霉素、恩诺沙星、美罗培南、头孢曲松、多西环素、头孢吡肟、诺氟沙星比较敏感，而对红霉素和氨苄西林不敏感，对其他药物如硫酸新霉素、利福平、氟苯尼考、土霉素、庆大霉素和磺胺甲恶唑的敏感情况差异较大。 （3）生化鉴定结果显示，在48项G-菌鉴定项目中，所有的菌都反应为阳性的项目为丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶、D-葡萄糖和L-脯氨酸芳胺酶三种，而反应为阴性的项目有侧金盏花醇、L-阿拉伯醇等26项，所有菌都表现为O/129敏感；吡咯烷基芳胺酶、β-半乳糖苷酶等其他项目的反应则有所不同，表现了各自特有的生化特征。 （4）对10株哈维氏弧菌Vh1、Vh2、Vh3、Vh4、toxS、Hcp、Zot和Pap6基因的检测，结果显示：Hcp基因总检出率和强毒株中检出率最高，均为50%；Vh1、Zot和Pap6基因的总检出率较低，均为10%，但是Zot基因在强毒株中检出率较高，为16.7%，而Vh1和Pap6基因在强毒株中没有检出；toxS、Vh2、Vh3和Vh4基因在所有菌株中均未检测到。我国南方地区的哈维氏弧菌无论强弱毒株都很少携带Pap6和4种Vh基因，而Hcp和Zot在强毒株中的检出率等于或高于各自的总检出率，结果显示，这10株菌株的致病性强弱差异与这两种毒力因子的存在有一定的相关性。 （5）强毒株Vh21220、Vh31487和弱毒株Vh21229分泌的胞外蛋白分别进行了SDS-PAGE电泳和质谱分析，结果显示：Vh21220和Vh31487高表达的都是外膜蛋白（OmpU），表达量最多的外膜蛋白的分子量大小分别是36.4KDa和35.8KDa，等电点值分别为4.26和4.19，而 Vh21229高表达的是氨基肽酶，分子量大小是65.5Kda，等电点值为5.32，提示前两株菌致病性较强的原因可能是外膜蛋白对宿主的致病作用比氨基肽酶强。

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第一章 引 言

1.1 哈维氏弧菌简介

1.2哈维氏弧菌鉴定方法研究

1.3 脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型方法的研究

1.4 哈维氏弧菌免疫防治

1.5 研究目的及意义

第二章 水产养殖源哈维氏弧菌的分离与鉴定

2.1 材料与方法

2.2鉴定结果

2.3讨论

本章小结

第三章 水产养殖源哈维氏弧菌的流行特征分析

3.1 材料与方法

3.2结果

3.3讨论

本章小结

第四章 部分特征菌株的致病性及其生物学特性

4.1材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

本章小结

参考文献

致谢