鲫血髓过氧化物酶表达与吡喹酮血药浓度的关联性及中草药对其影响的研究

摘要

髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）广泛地存在于动物体内，参与了体内多种生理反应。当机体受到刺激而产生应激反应时，髓过氧化物酶含量迅速升高，表现出强烈的氧化活性，可以杀灭入侵的微生物、增强免疫等。同时，髓过氧化物酶表现出来的强氧化性对药物的氧化代谢也具有重要作用。吡喹酮（praziquantel，PZQ）是一种喹啉吡嗪衍生物，作为抗寄生虫药物，广泛应用于水产上。本研究拟以吡喹酮为模式药物，鲫为模式生物，分析了鲫在单剂量口灌吡喹酮后，鲫血髓过氧化物酶基因在mRNA水平的表达与血液中吡喹酮浓度的关系，并且研究了黄芪、柴胡、黄连三种中草药对吡喹酮代谢以及髓过氧化物酶基因mRNA水平表达的影响，尝试建立一种利用髓过氧化物酶基因表达评价鱼类体内药物残留的方法，并为进一步建立健全水产养殖安全用药体系提供理论基础。本文中的主要研究以及结果如下： 1.鲫血髓过氧化物酶（MPO）mRNA的表达与血药浓度关联性 本实验以鲫为试验动物，单剂量（10mg/kg）口灌吡喹酮后，在鲫血液中选取β-actin为内参基因，通过荧光定量PCR，分析了不同时间点鲫血液中MPO mRNA水平的相对表达量的变化；利用高效液相色谱（HPLC）技术，测定了吡喹酮在鲫体内的血药浓度，分析两者之间的相关性。结果显示，吡喹酮能够迅速进入血液，并被快速消除，血药浓度与时间关系曲线符合二室开放模型。在1h时，血液中吡喹酮的浓度达到最大值，96h后血液中检测不到吡喹酮；灌药后，髓过氧化物酶基因表达量随时间表现出先升高后下降现象，在1h时髓过氧化物酶基因表达量最高。此外，0.25 h组、0.5 h组、1 h组、3 h组与6 h组与对照组差异性极显著（P＜0.01，下同），12 h组和24 h组与对照组差异性显著（P＜0.05，下同）。48 h与96 h组与对照组差异不显著（P＞0.05，下同）。相关性分析发现，MPO mRNA相对表达量与血液吡喹酮浓度之间的相关系数r=0.967，为高度相关，并且推测MPO可能参与吡喹酮的氧化代谢。 2.黄芪、黄连与柴胡对鲫体内吡喹酮的代谢影响 鲫连续投喂分别添加有黄芪、柴胡和黄连的饲料，同时以喂食无中草药添加饲料的鲫作为对照。持续喂食三十天后，各组鲫分别以10 mg/kg的给药剂量单次口灌吡喹酮，给药4 h后恢复正常投饵，并且分别于口灌后0.25 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48h、96 h尾静脉取血（每个时间点5尾），通过高效液相色谱技术分析口灌吡喹酮后不同时间点血液中吡喹酮浓度。结果显示，吡喹酮药时数据在各组鲫血液中符合二室开放模型。各组血液中吡喹酮浓度呈现先上升后迅速下降趋势，对照组鲫血液中吡喹酮达峰时间(Tmax)为1 h，峰值(Cmax)为2.71 mg·L-1，黄芪组鲫血液中吡喹酮达峰时间(Tmax)为1 h，峰值(Cmax)为2.90 mg·L-1，柴胡组鲫血液中吡喹酮达峰时间(Tmax)为1 h，峰值(Cmax)为3.01 mg·L-1；黄连组鲫血液中吡喹酮达峰时间(Tmax)为3 h，峰值(Cmax)为2.50 mg·L-1。黄芪组、柴胡组和黄连组消除半衰期(t1/2β)分别为78.69 h、61.708 h、56.967 h，皆大于对照组的15.007 h。黄芪组、柴胡组和黄连组的药时曲线下面积(AUC(0-∞))分别为136.591?g/L·h、75.009?g/L·h、77.69?g/L·h，分别约为对照组的4.43倍、2.44倍和2.52倍。黄芪组、柴胡组和黄连组的总体清除率(CL/F)分别为0.073 L/kg、0.133 L/kg、0.129 L/kg，较对照组的0.325 L/kg显著降低。说明黄芪、柴胡和黄连虽然能够提高吡喹酮在鲫体内的生物利用率，但是却大大延缓其代谢，致使吡喹酮在鲫体内的残留时间延长。水产上中草药与吡喹酮配伍使用时应当慎重。 3.黄芪、黄连与柴胡对鲫血液中髓过氧化物酶（MPO）mRNA表达的影响 本研究通过对鲫连续投喂分别添加有黄芪、柴胡和黄连的饲料，同时以喂食无中草药添加饲料的鲫作为对照。持续投喂三十天后，各组鲫鱼分别以10mg/kg的给药剂量单次口灌吡喹酮，以喂食无中草药添加饲料并且未口灌吡喹酮的鲫作为空白对照，并且于灌药1h后于各组鲫尾静脉取血，（每个组5尾），利用荧光定量PCR，分析各组鲫外周血中MPO mRNA水平的相对表达量的变化。结果显示，对照组髓过氧化物酶表达量相对于空白对照组明显升高，说明吡喹酮诱导了鲫体内髓过氧化物酶的表达，而黄芪组、柴胡组和黄连组髓过氧化物酶表达量相对于对照组显著降低，说明三种中草药对髓过氧化物酶的表达均有抑制作用。