碳酸盐碱度胁迫下尼罗罗非鱼HCO3-离子代谢和转运的途径

摘要

在碳酸盐型水环境中，鱼类除了维持渗透压调节外，还面临着酸碱平衡调节的压力。通常认为，碳酸盐型碱水对鱼类生存影响主要通过干扰其血液缓冲系统。其中，HCO3-是血液缓冲系统中最重要的组成成分。尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）是重要的淡水养殖鱼类，同时，对碳酸盐碱度有一定的耐受能力。本论文以尼罗罗非鱼为材料，开展了不同浓度（0、2和4 g/L NaHCO3）碳酸盐碱度急性胁迫实验，分析了尼罗罗非鱼的生理水平（血清渗透压、Na+、K+、Cl-、HCO3-浓度、pH）、生化水平（CAⅡ、CAⅣ、SLC4A4、SLC26A6酶活力）、细胞水平（鳃离子细胞亚型、数目、开孔大小）、分子水平（CAⅡ、CAⅣ、SLC4A4、SLC26A6基因和蛋白相对表达量）变化情况，旨在研究碳酸盐碱度胁迫下，罗非鱼如何实现体内HCO3-的调节。主要结果如下：
　　（1）采用扫描电镜和免疫组化技术，观察了不同碳酸盐碱度（0、2、4 g/L NaHCO3）胁迫对尼罗罗非鱼鳃离子细胞形态变化的影响以及鳃、肾、肠中碳酸酐酶Ⅱ（CAⅡ）、碳酸酐酶Ⅳ（CAⅣ）、Na+/HCO3-协同转运载体（SLC4A4）、Cl-/HCO3-离子交换体（SLC26A6）的免疫组化反应变化。扫描电镜结果表明，鳃离子细胞分布在鳃小片基部。根据其表面开孔形状和尺寸，可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型4种亚型，各亚型离子细胞的开孔尺寸随碳酸盐碱度升高呈正比增大，Ⅲ型离子细胞开孔尺寸变化最明显（P＜0.01）；离子细胞总数目也随碳酸盐碱度升高而增加，Ⅲ型细胞数目上升最为显著（P＜0.01）。免疫组化结果表明，在淡水、碳酸盐碱水组中， CAⅡ、CAⅣ、SLC4A4、SLC26A6在鳃小片基部和肾脏中均有阳性反应，且随着碳酸盐碱度升高，阳性反应增强，但在肠道中未观察到阳性反应。结果初步表明，尼罗罗非鱼可通过调节鳃离子细胞形态和数量适应碳酸盐碱度变化，鳃和肾为主要应答调节器官。
　　（2）为了探讨鱼类在碳酸盐碱水环境中的渗透调节机制，将尼罗罗非鱼从淡水直接转入2 g/L和4 g/L NaHCO3碱水中进行急性胁迫试验，分别检测胁迫后0、3、6、12、24、48、72、96和192 h时血清渗透压、血清 Na+、K+、Cl-和 HCO3-浓度以及鳃、肾和肠中酶碳酸酐酶（CAⅡ、CAⅣ）、Na+/HCO3-协同转运载体（SLC4A4）、Cl-/HCO3-离子交换体（SLC26A6）酶活力变化。结果显示：不同碳酸盐碱度胁迫下，尼罗罗非鱼血清渗透压、离子浓度以及鳃、肾、肠中相关调节因子酶活力均随碳酸盐碱度升高而升高。随时间推移，血清渗透压、离子浓度呈现先上升、后下降的变化趋势，24 h达到峰值；鳃、肾和肠中CAⅡ、CAⅣ、SLC4A4、SLC26A6酶活力均呈现先短时间降低、后升高、再降低并趋于稳定的趋势。研究表明，尼罗罗非鱼具有一定的碳酸盐碱环境适应能力，CAⅡ、CAⅣ、SLC4A4、SLC26A6参与碳酸盐碱胁迫下离子转运、渗透压平衡调节。
　　（3）为了探讨碳酸盐碱环境中鱼体内 HCO3-代谢和转运相关机制，将尼罗罗非鱼从淡水直接转入2个碳酸盐碱度（2.0、4.0 g/LNaHCO3）处理组中进行急性胁迫试验。利用pH计、荧光定量PCR和Western-blotting技术，分别检测胁迫0、3、6、12、24、48、72、96和192 h的尼罗罗非鱼血清pH、鳃、肾和肠等组织中碳酸酐酶（CAⅡ、CAⅣ）、Na+/HCO3-协同转运载体（SLC4A4）、Cl-/HCO3-离子交换体（SLC26A6）基因mRNA和蛋白的相对表达量。结果显示：在碳酸盐碱度胁迫下，随时间推移，尼罗罗非鱼血清pH呈现先升高、后降低的变化趋势，推测尼罗罗非鱼在进入高渗环境后，水环境中的HCO3-进入到血液中，从而引起鱼体内酸碱平衡的变化，进一步导致血液pH升高。荧光定量PCR结果表明：随碳酸盐碱度升高，鳃、肾和肠中的CAⅡ、CAⅣ、SLC4A4和SLC26A6 mRNA表达量显著升高（P＜0.05），相较于鳃和肾，肠中这些基因的mRNA表达量较低。Western-blotting结果显示：淡水和碳酸盐碱水环境下，鳃和肾中四种蛋白均有表达，并且呈现先短时间降低、后升高、再降低的变化趋势；在肠道中只检测到少量的SLC26A6蛋白表达。初步推断在碳酸盐碱环境下，尼罗罗非鱼能够通过启动鳃、肾和肠组织中的相关调节因子基因和蛋白来调节体内的HCO3-浓度，以维持机体的酸碱平衡。

目录

声明

第一章 引 言

1.1立题依据

1.2 国内外研究进展

1.3 课题来源

1.4 研究内容及意义

第二章 碳酸盐碱度对尼罗罗非鱼鳃离子细胞形态以及鳃、肾和肠中HCO3-调节因子的影响

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3结果

2.4讨论

第三章 碳酸盐碱度对尼罗罗非鱼血清渗透压、离子浓度及HCO3-调节因子酶活力的影响

3.1 前言

3.2 材料和方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四章 碳酸盐碱度对尼罗罗非鱼血清pH、HCO3-调节因子基因mRNA和蛋白表达的影响

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.3结果

4.4讨论

小结

参考文献

硕士期间发表论文

致谢