三角帆蚌酪氨酸酶相关基因克隆及对珍珠层颜色影响研究

摘要

三角帆蚌是我国最主要的淡水育珠贝，珍珠颜色对珍珠价值有重要影响，研究表明珍珠颜色主要受供片蚌贝壳珍珠层颜色影响。酪氨酸酶参与了黑色素形成，与贝壳珍珠层颜色有关。本研究从分泌白色与紫色珍珠质三角帆蚌外套膜和珍珠囊比较转录组中筛选出与三角帆蚌珍珠层颜色相关的酪氨酸酶基因，以白色与紫色家系三角帆蚌为实验材料，探究酪氨酸酶与三角帆蚌珍珠层颜色之间的关系。
　　1.三角帆蚌Hctyr基因的克隆与表达分析
　　克隆得到三角帆蚌酪氨酸酶基因HcTyr，全长2315bp，开放阅读框（ORF）长1989bp，编码662个氨基酸。HcTyr基因包含一个酪氨酸酶结构域，无信号肽，GenBank登录号为KX447816。荧光定量结果发现，HcTyr基因主要在三角帆蚌外套膜中表达，其他组织中几乎不表达。白色蚌中，在外套膜前端缘膜、中央膜以及后端缘膜的表达量几乎处于同一水平。紫色蚌中，从前端缘膜、中央膜到后端缘膜表达量逐渐上升。紫色蚌后端缘膜中基因表达量显著高于白色蚌（P＜0.05）。原位杂交结果表明，HcTyr基因在外套膜的背膜上皮细胞中有明显的阳性杂交信号。对三角帆蚌外套膜中酪氨酸酶的活性进行检测发现，紫色三角帆蚌外套膜中酪氨酸酶活性要显著高于白色蚌。
　　2.三角帆蚌HcTyp-1基因克隆与表达分析
　　从三角帆蚌中克隆获得一个酪氨酸酶类似蛋白HcTyp-1，基因全长3590bp，编码了778个氨基酸。它包含了一个酪氨酸酶结构域与一个几丁质结合域，氨基酸序列包含一个由20个氨基酸残基构成的信号肽，GenBank登录号为KX447817。根据荧光定量结果显示，HcTyp-1基因主要在三角帆蚌外套膜中表达，其他组织中几乎不表达。在白色三角帆蚌中HcTyp-1在前端缘膜以及中央膜中表达量最高，后端缘膜表达量相对较低；在紫色的三角帆蚌中HcTyp-1基因在前端缘膜表达量较高，后端缘膜表达量较低。并且白色蚌的后端缘膜以及中央膜的表达量要显著高于紫色蚌（p＜0.05）。根据外套膜的原位杂交结果表明，HcTyp-1基因在三角帆蚌背膜处的上皮细胞检测到明显杂交信号，同时在外套膜中褶的上皮细胞中也检测到一些杂交信号。
　　3.三角帆蚌HcTyp-1基因SNP筛选及与珍珠层颜色性状关联性分析
　　根据酪氨酸酶类似蛋白HcTyp-1基因cDNA设计引物，比较筛选获得了8个SNP位点。研究这些多态性位点与贝壳珍珠层颜色性状相关性发现，C+3057T位点基因型仅在a参数上存在显著差异(P＜0.05)，G+2985T和T+3006C两个位点基因型分别在L、b及a、dE上存在显著差异(P＜0.05)，A+2834C、C+2919T和G+2986T这3个SNPs位点基因型在L、a及dE上均存在显著差异(P＜0.05)。连锁不平衡结果显示，HcTyp-1基因上除C+2912T、C+2983A这两个其它6位点具有差异显著位点之间都存在强连锁不平衡。单倍型分析发现，单倍型T2和T4在白色蚌中出现的频率极显著高于在紫色蚌中出现的频率，T6和 T8两种单倍型在紫色群体中出现的频率极显著高于白色群体。HcTyp-1基因的部分SNPs可作为三角帆蚌抗不同内壳色贝壳辅助育种的候选分子标记。

目录

声明

引言

第一章 文献综述

1.贝类珍珠层研究进展

1.1金属离子致色机理

1.2珍珠结构致色机理

1.3有机物致色机理

1.4珍珠呈色相关基因研究

2. 酪氨酸酶的研究进展

3.研究目的

第二章 三角帆蚌酪氨酸酶基因HcTyr的克隆与表达分析

2.1材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.2结果

2.2.1基因全长及序列分析

2.2.2多重比对与系统发育分析

2.2.3荧光定量分析

2.2.4原核表达与蛋白重组结果

2.2.5抗体的特异性检测

2.2.6原位杂交结果

2.2.7组织酪氨酸酶活性测定结果

2.3讨论

第3章三角帆蚌HcTyp-1基因的克隆与表达分析

3.1材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2实验设备与仪器

3.1.3实验方法

3.2结果

3.2.1基因全长与序列分析

3.2.2系统发育分析

3.2.3组织表达分析

3.2.4原位杂交结果

3.3讨论

第四章 三角帆蚌HcTyp-1基因的SNP筛选以及与珍珠层颜色性状的关联性分析

4.1材料与方法

4.1.1实验材料

4.1.2实验方法

4.2 结果

4.2.1 SNP位点筛选

4.2.2多态性分析

4.2.3 三角帆蚌HcTyp-1基因SNPs位点与内壳色性状关联分析

4.2.4 三角帆蚌HcTyp-1基因SNP位点连锁不平衡及单倍型分析

4.2.5 三角帆蚌HcTyp-1基因在三角帆蚌微卫星图谱上定位

4.3 讨论

结论

参考文献

附录

致谢