MiRNA及其合成通路相关基因在三疣梭子蟹性腺发育过程中的功能分析

摘要

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）广泛分布于太平洋西部海岸的温带地区，是东亚各国重要的海洋渔业资源，也是中国重要的养殖对象。在过去的十年中，中国三疣梭子蟹养殖业发展迅速，2014年其总产量已达到118836吨。然而，由于三疣梭子蟹养殖规模的迅速扩大以及繁殖调控技术的缺乏，优质的三疣梭子蟹的产量已不能满足日益增长的需求。繁殖调控技术的缺乏已经成为制约该产业可持续发展的关键问题。近年来，三疣梭子蟹的繁殖调控机制的研究越来越受到人们的重视。性腺是生物体进行有性生殖产生配子的主要器官，有众多调节因子参与了配子发生过程的调控。目前，甲壳类性腺发育和配子发生过程调控机制的研究主要集中在转录水平，转录后水平的研究较少。miRNAs作为一类重要的转录后调节因子，其在性腺发育过程的功能得到了广泛的关注。本研究分析了三疣梭子蟹繁殖相关miRNA及其合成通路的重要基因在性腺发育过程的功能，主要研究结果如下：
　　1.MiRNA合成通路相关基因在三疣梭子蟹性腺发育过程中的表达分析
　　已知，Drosha、Exportin5、Dicer1和Argonaute1(AGO1)基因是miRNA合成通路的重要基因，而Dicer2和Argonaute2(AGO2)则主要参与siRNA的合成调控。为研究上述基因在三疣梭子蟹性腺发育过程中的功能作用，本实验利用RACE技术克隆了上述基因的cDNA全长序列，同时进行序列分析、同源分析和进化树分析发现，Drosha、Dicer1和AGO1在进化上高度保守，与各自亲缘关系较近的物种的蛋白质序列相似度普遍较高（83％-99%），而Exportin5、Dicer2和AGO2则保守性较低（序列相似度44%-51%）。
　　对三疣梭子蟹Drosha、Exportin5、Dicer1、Dicer2、ADO1和ADO2基因进行组织差异性表达分析，结果显示上述基因在各种组织中均表达，且多种在肝胰腺或卵巢中高表达，其次为精巢等。对各基因在精巢发育不同时期的表达分析发现，Drosha、Exportin5、Dicer1和AGO1基因的表达量均在II期达到最高，且各基因在不同时期表达变化趋势基本一致。Dicer2和AGO2均在I期高表达（P＜0.05），其他时期差异不大。在卵巢发育不同时期，Drosha与Exportin5基因在卵巢发育不同时期表达量变化趋势大致相同，都是随着卵巢发育（从II期到 V期）逐渐升高，在V期达到最大值(P＜0.05)。Dicer1与AGO1在各时期表达量变化趋势也基本一致，从I期到III期表达量变化不大，IV期迅速上调，V期达到峰值，VI期又迅速下调。Dicer2与AGO2在各时期表达变化趋势也基本一致，都是在II期和V期显著高于其他时期(P＜0.05)。因此，我们推测Drosha、Exportin5、Dicer1、Dicer2、AGO1和AGO2基因均参与了三疣梭子蟹性腺发育的调控，同时暗示miRNAs和siRNA可能在相应时期发挥重要作用。
　　2.三疣梭子蟹精巢和卵巢miRNA的鉴定与比较分析
　　为研究miRNAs在三疣梭子蟹性腺发育过程中的功能作用，对三疣梭子蟹性腺相关miRNAs进行鉴定和分析。利用Illumina测序技术，在卵巢和精巢中共识别了188个已知的和65个新的miRNAs。其中多个miRNA，如let-7、let-7c、let-7f，mir-2，mir-184和mir-276，在卵巢和精巢组织中均大量表达，暗示其在性腺发育和功能发挥过程中的重要作用。表达分析发现，75个miRNA在卵巢和精巢之间差异表达。同时KEGG分析发现，这些miRNAs的靶基因显著富集于几种与繁殖相关的信号转导通路，如促性腺激素释放激素信号通路，卵巢的类固醇和Wnt信号通路。进一步的miRNA表达分析表明，某些miRNA在卵巢（mir-9，mir-125和mir-27a）和精巢（mir-7，mir-87和mir-2788）发育过程中的表达方式具有阶段特异性。暗示它们在三疣梭子蟹性腺发育不同时期发挥不同的功能。本研究结果将为甲壳类繁殖相关miRNA介导的转录后基因调控的进一步研究提供重要参考。

目录

声明

第一章 引 言

1 三疣梭子蟹的概述

1.1 三疣梭子蟹的分类

1.2 三疣梭子蟹的形态结构

1.3 三疣梭子蟹的生活习性

1.4 三疣梭子蟹的性腺发育

2. miRNA的相关研究

2.1 miRNA的发现

2.2 miRNA的生物合成和作用机制

2.3 miRNAs在性腺发育方面的研究

3 本研究的目的与意义

第二章 三疣梭子蟹Drosha、Exportin5、Dicer 1、Dicer 2、AGO 1和AGO 2基因克隆及其在性腺发育不同时期的表达分析

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 实验结果

2.1三疣梭子蟹Drosha、Exportin 5、Dicer 1、Dicer 2、AGO 1和AGO 2基因cDNA全长的获得和序列分析

2.2三疣梭子蟹Drosha、Exportin 5、Dicer 1、Dicer 2、AGO 1和AGO 2基因同源性及系统进化树分析

2.3三疣梭子蟹Drosha、Exportin 5、Dicer 1、Dicer 2、AGO 1和AGO 2基因组织差异表达分析

2.4 三疣梭子蟹Drosha、Exportin 5、Dicer 1、Dicer 2、AGO 1和AGO 2基因在精巢发育不同时期的差异表达分析

2.5 三疣梭子蟹Drosha、Exportin 5、Dicer 1、Dicer 2、AGO 1和AGO 2基因在卵巢发育不同时期的差异表达分析

3 讨论

3.1 序列及同源进化树分析相关讨论

3.2 表达分析相关讨论

第三章 三疣梭子蟹精巢和卵巢miRNA的鉴定与比较分析

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 实验结果

2.1三疣梭子蟹性腺相关小RNA的概述

2.2已知和未知miRNAs的鉴定和表达分析

2.3卵巢和精巢miRNAs的差异表达分析

2.4目的基因预测，GO分类和KEGG通路分析

2.5 组织特异miRNAs在性腺发育过程中的表达模式

3 讨论

小结

参考文献

致谢

硕士期间论文发表情况