双功能肽修饰的生物可降解纳米基因载体P407-PEI-K12的构建

摘要

基因疗法是近年来建立在基因工程技术和分子遗传学原理基础上的新型治疗方法。因肿瘤发生、发展的生物学基础是基因突变，相比传统治疗，基因治疗是最有可能从根本上根除肿瘤的方法。基因治疗涉及三个环节，即目的基因、转基因载体和靶细胞。
　　现阶段尚缺乏理想的转基因载体，由此我们设计合成了一种新型的非病毒基因载体。首先利用泊洛沙姆P407交联低分子量PEI得到分子量较高的PEI衍生物P407-PEI，通过调整反应比得到系列PEI衍生物，选出其中转染效率高且细胞毒性小的聚合物。之后设计合成一种能靶向于肿瘤细胞，并提高核递送能力的双功能肽tLyP-1-NLS（命名为K12）。K12包括连接能靶向于肿瘤细胞表面NRP受体的tLyP-1多肽和可被核膜输入蛋白识别的核定位信号肽NLS。利用交联技术将P407-PEI与K12偶联，合成新型非病毒基因载体P407-PEI-K12。最后， P407-PEI-K12与DNA自装配成纳米复合物，通过添加游离的泊洛沙姆P407形成温敏性缓释水凝胶，为基因治疗探索有效途径。
　　第一部分，探讨了聚乙烯亚胺以及泊洛沙姆嵌段共聚物和功能肽用于非病毒基因载体的研究现状，在基因载体的应用中存在的主要问题，并讨论了可能的优化策略。
　　第二部分，P407-PEI-K12的合成及表征。第一步采用固相Fmoc法合成双功能肽K12，K12由tLyP-1肽、NLS两个短肽连接而成，具有肿瘤靶向性和提高核递送能力的特点。合成双功能肽K12后，MS分析鉴定序列与设计序列一致， HPLC测定含量为98.75％，符合后续实验投料要求。第二步使用细胞毒性较低的泊洛沙姆P407连接不同比例的低分子量PEI，得到中间产物P407-PEI。最后， K12肽与P407-PEI通过SMCC法偶联，得到最终聚合物P407-PEI-K12。将合成好的产物与初产物进行1H-NMR检测，通过对比分析说明双功能肽K12已与P407-PEI相连形成P407-PEI-K12。
　　第三部分，考察了P407-PEI-K12的理化性质。第一步，验证出其具有良好的pH缓冲和水解能力。第二步，通过仪器检测得出P407-PEI-K12/DNA复合物粒径都在200-500 nm之间，Zeta电位处于5-35 mV之间，适合在体内运转。第三步，通过凝胶实验考察得出聚合物P407-PEI-K12-h和P407-PEI-K12-l可以有效包合DNA。第四步，模拟体内环境，考查了聚合物对DNA的保护作用。实验表明，P407-PEI-K12可保护DNA抵抗大于63 U DNase I/μg DNA、50%血清和大约600μg/mL肝素钠的降解，且对B16细胞的细胞毒性相对较低。具备一个符合条件的基因传递体的基本要求，有进一步研究的价值。
　　第四部分，体外考察P407-PEI-K12/DNA复合物的转染效率以及基于P407的温敏型凝胶缓释性能。第一步分别定性和定量考察复合物对目标细胞的转染并评价聚合物的转染效率。结果表明，在P407交联PEI后，转染效率有所提高，其中P407-10g-PEI最高；在P407-10g-PEI上偶联功能肽K12后，可提高复合物肿瘤靶向性并协助载体更好的穿过细胞核膜，进入细胞核；游离泊洛沙姆P407的加入在一定范围内可以提高P407-PEI-K12转染效率，当添加的量达到0.09%时，促进转染作用最强。第二步考察了泊洛沙姆P407温敏型凝胶的相关理化性质：一定浓度游离泊洛沙姆P407溶液在温度升高到37℃下可以形成稳定凝胶，质地均匀细腻、透明，有一定弹性和粘性，稳定性表现良好。第三步， P407-PEI-K12-h和P407-PEI-K12-l分别与pGL3-Control自装配成纳米复合物，通过添加游离泊洛沙姆P407为药物缓释载体，形成缓释水凝胶。以PEI2 KDa为对照，评价P407-PEI-K12/pGL3-Control复合物缓释水凝胶的释放液体的转染功能。结果表明，复合物缓释水凝胶溶蚀液体具有转染功能，凝胶在水解过程中，不断放出复合物可以获得持续基因表达，随之溶解的游离泊洛沙姆P407可以增加复合物转染效率，进而提高肿瘤的基因治疗效果。
　　本课题通过基团修饰的方法，合成聚合物P407-PEI-K12以期解决PEI作为基因载体使用中的不足。在增加其靶向性和核递送能力情况下，载体自身细胞毒性依然较低。通过添加游离的泊洛沙姆P407形成温敏型缓释水凝胶。凝胶在水解过程中，不断释放复合物可以获得持续基因表达。随之溶解的游离泊洛沙姆P407在一定浓度范围内可以增加复合物转染效率，起到持续高效递送基因的作用，为基因治疗探索有效途径。

目录

引言

第一章 聚乙烯亚胺构建的纳米基因载体的研究进展

1.1 PEI在基因载体中的应用

1.2 泊洛沙姆嵌段共聚物在基因载体的应用

1.3 功能肽在基因载体的应用

1.4 结语

第二章 P407-PEI-K12的合成与表征

2.1材料与仪器

2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.4 结论

第三章 P407-PEI-K12理化性质

3.1 试剂与仪器

3.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.4 结论

第四章 P407-PEI-K12的体外转染

4.1 试剂与仪器

4.2 实验方法

4.3 结果与讨论

4.4 结论

全文总结

参考文献

致谢