三角帆蚌两个半乳糖凝集素基因的免疫功能及育珠移植免疫生理指示作用研究

摘要

三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是我国最主要的淡水珍珠贝。在珍珠养殖过程中，外套膜小片移植手术，即插片手术，是十分重要的技术环节。插片手术后，经过一系列的免疫反应，外套膜小片形成珍珠囊，珍珠在珍珠囊里形成。同时，手术也会对育珠贝造成很大的伤害，甚至会因为感染而死亡。如何采取有效管理措施缓解外套膜小片与育珠贝间免疫排斥反应，降低插片手术以后育珠贝受细菌等病原微生物感染率，成为提高珍珠质量和产量的重要课题。目前，外套膜小片移植手术后，育珠贝和外套膜小片的免疫生理过程仍不清楚。免疫基因的表达变化可反映免疫生理过程，具有指示作用。凝集素是重要的模式识别受体可识别多种病原微生物及其他异物，调控后续系列免疫反应。本研究从三角帆蚌体内鉴定出了2个半乳糖凝集素基因（Galectin），对它们的结构和功能进行了全面而系统的研究，并分析了2个基因在育珠移植免疫过程中的指示作用，揭示了生理反应关键点，以期为育珠生产过程中及时采取有效处理措施提供理论依据。得到了以下研究结果：
　　1.两个半乳糖凝集素基因的cDNA全长序列的克隆及结构分析
　　我们克隆获得2个半乳糖凝集素基因，分别命名为HcGal1和HcGal2。HcGal1基因的cDNA序列全长为1917 bp，其中包括140bp的5’端非翻译区（UTR），838 bp的3’端非翻译区，以及939 bp的开放阅读框，编码了312个氨基酸。包含2个CRD。预测HcGal1的蛋白分子量和理论等电点分别为35.5kDa和9.54，没有信号肽。HcGal2基因的cDNA序列全长为797 bp，包括80 bp的5’端UTR，267 bp的3’端UTR，以及450 bp的开放阅读框，编码149个氨基酸。包含1个CRD。预测的蛋白分子量和理论等电点分别为17.2kDa和7.82，没有信号肽。
　　2.两个半乳糖凝集素基因组织表达分析
　　荧光定量PCR检测发现，2个基因的mRNA在三角帆蚌各个组织中都有表达，其中 HcGal1在血细胞中表达最高，血液是三角帆蚌重要的免疫组织，而HcGal1基因在血细胞中的高表达可以初步推测其发挥着重要的免疫作用。HcGal2在外套膜中的表达量最高，外套膜是贝类免疫的第一道防线，这也表明HcGal2发挥着重要的免疫作用。Western blot分析表明，2个基因在蛋白水平的表达与mRNA的表达不一致，推测是由于mRNA的转录后调控造成，即机体会根据自身的需要以降解的方式清除不需要表达的mRNA，或者是通过改变mRNA的半衰期等来控制基因表达的程度以及蛋白产物的生产。
　　3.两个半乳糖凝集素基因细菌诱导后的相应表达
　　2个基因在血细胞、外套膜、肝脏经革兰氏阴性菌、阳性菌刺激后均呈现显著性上调的趋势，表明HcGal1和HcGal2可以起到抑菌、杀菌的作用，从而达到清除病原菌的目的。并且HcGal1和HcGal2在不同组织中对于不同细菌的效应时间有所不同，说明HcGal1和HcGal2在不同的组织中对于每种细菌的敏感度是有所不同的，原因可能是由于两个基因的CRD结构域的不同，使得它们对不同细菌表面的糖类的识别与结合能力有所不同。
　　4.两个半乳糖凝集素基因蛋白水平的功能研究
　　原核表达出了2个基因的重组蛋白，细菌凝集实验显示2个基因的蛋白均能够凝集一些菌种，表明2个基因均能够识别并且抵御病原微生物的入侵。将2个基因的重组蛋白注射到蚌体后，检测血细胞对异物的吞噬效率，结果显示注射了重组蛋白的血细胞吞噬效率比对照组显著性地增强，表明2个基因的重组蛋白能够促进血细胞的吞噬作用，从而杀死病原菌。
　　5.育珠移植免疫生理过程指示作用研究
　　插片手术以后，2个基因在被检测的各个组织中呈现了不同的表达模式，推测HcGal2基因对于“非己”物质有强烈的免疫排斥反应。而HcGal1基因则可能是参与了机体的负反馈调节，通过降低mRNA水平减小机体对异物的排斥而使移植小片不脱落。另外，根据基因的表达变化以及对珍珠囊形成过程的肉眼观察，可将插核后移植免疫分为3个关键生理期，即静歇期（0-24 h），伤口愈合和珍珠囊形成期（24 h-7 d）和珍珠形成期（7天以后）。通过基因在这几个时期的表达变化，可以在我们生产上起到生理指示作用，研究免疫基因的表达与插片手术后机体的生理反应之间的关系，及时的对养殖环境做出调整，以降低蚌体的感染率和脱片率，提高成活率和珍珠质量。

目录

声明

引言

第一章 无脊椎动物免疫系统与凝集素的研究进展

1 免疫系统

2 无脊椎动物的先天免疫

3 无脊椎动物凝集素的研究进展

4本研究的目的和意义

第二章 三角帆蚌2个半乳糖凝集素基因的cDNA全长的克隆及表达分析

1 实验材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 三角帆蚌2个半乳糖凝集素基因细菌诱导后的表达研究

1 实验材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 三角帆蚌2个半乳糖凝集素基因蛋白水平的功能研究

1 实验材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第五章 三角帆蚌2个半乳糖凝集素基因的育珠移植免疫生理指示作用研究

1 实验材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

结论

参考文献

附录

致谢