红鳍东方鲀低温转录组基因差异表达分析及系谱认证研究

摘要

红鳍东方鲀是我国北方的经济养殖品种，为了提高种质质量，减少养殖过程中产生的经济损失，实验从红鳍东方鲀系谱认证、耐寒基因筛选及低温相关调节机制开展相关研究。利用微卫星标记技术、实时荧光定量技术和转录组数据分析等对红鳍东方鲀养殖家系进行科学研究。
　　选取18℃、8℃、5℃胁迫下的肝脏组织进行转录组测序，通过KEGG数据库对差异基因进行Pathway分析，结果显示差异基因主要集中在新陈代谢通路，而且在信号转导、运输和代谢方面差异基因存在较多。通过GO功能显著性富集分析，结果显示随着温度降低，与分子功能有关的部分消化酶活性均有不同程度的下调，这在一定程度上对鱼类自身机体的代谢强度产生了相关影响，酶活与调节机制代谢，信号转导等有着重要的联系作用。在温度下降的过程中，铁离子的结合和血红素的结合能力也呈下调趋势，这与低温环境下鱼类的活动减弱有着密不可分的关系。在低温胁迫下，鱼类活动减弱，呼吸变慢，吸入鱼体内部的氧气也随之减少，整个鱼体的溶氧情况对鱼体自身也起了一定的调节作用，鱼体在低温条件下，大部分的能量作为热能来平衡体内内环境与外界水温造成的温度差，鳃呼吸现象减弱，使得水中的氧气扩散到血液中的机会变少，机体细胞受到一定损伤，细胞膜通透性变大，于是外界离子进入体内，使得铁离子的结合能力降低。随着温度的下降，DNA结合、RNA结合、染色质结合、转录因子结合、蛋白质精氨酸甲基转移酶（protein arginine methyltransferase，PRMTs）及核心启动子序列结合相关的调控均呈上升趋势，我们认为这与相关蛋白功能的调控有密切关系，如蛋白质精氨酸甲基转移酶已发现在染色质结构的调控、蛋白质的拼接及组装、DNA修复、转录调节，信号转导等多个方面发挥着重要作用。
　　为了研究红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)相关耐低温机制，利用实时荧光定量（qPCR）技术，分析抗冻蛋白（AFP）、冷诱导RNA结合蛋白（CIRP）、高速迁移蛋白家族蛋白（HMGB1）、Y-box结合蛋白在温度18℃、13℃、8℃，5℃胁迫下，红鳍东方鲀肝、脾、肾、脑、心、肠、肌肉、性腺，皮中的基因表达的情况。据结果可知，4个基因在各个组织中均有表达，AFP基因在各组织中的表达量整体呈现递增趋势，在5℃时AFP基因在各组织中的表达量均达到最大，相比对照组表达量差异显著升高（P＜0.05）；CIRP基因在心、肠，皮的表达量随温度降至8℃时达到最大，在5℃时表达量有所降低，其中肠中CRIP基因的表达量在13℃、8℃，5℃时的表达量均显著高于对照组（P＜0.05），在脾、肌肉，性腺中， CIRP基因的表达量随温度的下降而呈现上升趋势，并均在5℃时表达量达到最大值与对照组差异显著（P＜0.05）；HMGB1基因在各个组织中的表达量均呈上升趋势，并在脾、肾、脑、心、肠，性腺中的表达量均与对照组形成显著性差异（P＜0.05），且在8℃时表达量达最大值，温度从8℃降到5℃时，HMGB1在各组织中的表达量呈下降趋势；Y-box基因在不同温度下的各个组织中均有表达，在5℃时，Y-box在组织脾，肠，性腺中其表达量明显高于对照组形成显著性差异（P＜0.05），在8℃时，Y-box在肌肉中的表达量显著高于对照组18℃（P＜0.05），13℃时，Y-box基因在脾、肾、脑、肠，性腺中的表达量显著高于对照组18℃（P＜0.05）。从结果得知，红鳍东方鲀AFP1基因和HMGB1基因与温度存在一定的相关性，说明AFP1基因和HMGB1基因在红鳍东方鲀低温胁迫下机体对冷刺激的调节发挥着重要的作用，CIRP基因和Y-box基因虽有不同程度的表达，但未发现明显变化规律，可能与基因对低温胁迫下作出的应答机制较为复杂有密切的关系。
　　本研究从2015年所建的12个红鳍东方鲀家系中随机选取5个家系，针对5个红鳍东方鲀家系，利用8个微卫星标记对其遗传多样性进行分析和系谱认证。8个位点共检测得到32个等位基因。每个位点等位基因范围从3到6，平均值为4。平均观测杂合度范围从0.4533到0.9533，平均期望杂合度范围从0.4908到0.7901，平均多态信息含量范围从0.4555到0.7546。不同位点共发现8个家系特异性等位基因，7＃家系发现3个，3＃和11＃家系各发现2个，12＃家系发现1个，10＃家系未发现特异性等位基因。根据子代基因型成功推断出5个家系的亲本基因型，据此鉴别各个家系。在fms15位点，可将3＃和11＃家系与其他家系相区别；TOG01位点可将7＃家系与其他家系相区别；f1497位点可将12＃家系相区别。因此，fms15，TOG01，f1497这三对标记可以作为鉴别5个家系的特异性标记。结果说明，所选的8个微卫星标记在这5个家系中多态信息含量较高，且在已选用的8个微卫星标记中，最少用3个微卫星标记可鉴别5个红鳍东方鲀家系。运用相同方法，我们采用7对微卫星引物对暗纹东方鲀遗传多样性进行分析和系谱认证。7个位点共检测得到29个等位基因。每个位点等位基因范围从3到6，平均值为4.1。平均观测杂合度范围从0.4917到0.9583，平均期望杂合度范围从0.5270到0.7691,平均多态信息含量范围从0.4669到0.7272。不同位点共发现3个家系特异性等位基因，6＃家系发现2个，12＃家系发现1个，11＃和14＃家系未发现特异性等位基因。根据子代基因型成功推断出4个家系的亲本基因型，据此鉴别各个家系。在f362位点或f169位点，可将6＃家系与其他家系相区别；f1372位点可将12＃家系与其他家系相区别；f1372位点可将11＃与14＃家系相区别。因此，f169和f1372，f362和f1372这两对标记可以作为鉴别4个家系的特异性标记。

目录

声明

引 言

第一章 综述

第二节 耐寒基因相关研究进展

第三节 系谱认证相关研究进展

第二章基于红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)低温转录组的调控机制的研究

1. 前言

2. 实验材料和方法

3.数据处理

4 结果

5 讨论

第三章红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)AFP、CIRP、Y-box和HMGB1基因的表达分析

1. 前言

2. 实验材料和方法

3. 数据处理

4.结果

5.讨论

小结

第四章 红鳍东方鲀和暗纹东方鲀的系谱认证

第一节 红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）的系谱认证研究

第二节 暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)的系谱认证研究

小结

参考文献

硕士期间科研产出情况

致谢