大菱鲆(Scophthalmus maximus)盐度胁迫转录组构建及相关功能基因研究

摘要

本文首先阐述了盐度胁迫对鱼类的影响，分别从鱼类生长、存活，营养组成，鱼类抗氧化酶，鱼类免疫能力，鱼类生理代谢等五个方向分析了盐度对鱼类的影响，从而揭示了研究盐度胁迫对鱼类影响的重要性。其后对大菱鲆微卫星遗传标记研究进展以及鱼类盐度相关基因的研究进展和大菱鲆转录组研究进展进行了综述，希望能将先辈的研究结果和本实验研究相结合，期望为大菱鲆渗透压研究的提供理论依据。
　　本研究采用荧光定量PCR技术对不同盐度胁迫下各时间点大菱鲆幼鱼肠、鳃中催乳素（PRL）基因和Na+-K+-ATPaseα1两种基因的表达量进行检测。以盐度30数据为对照组，5、10、40和50盐度为实验组，进行数据分析，结果显示：两种基因在两种组织中均有表达，且基因的表达量具有组织和时间特异性。肠组织PRL、Na+-K+-ATPaseα1基因的表达量，在盐度50和5条件下，随胁迫时间的积累呈先升高后降低的变化趋势；鳃组织PRL基因表达量，在盐度50和盐度5条件下，随胁迫时间积累先升高后降低；而Na+-K+-ATPaseα1基因表达量在低盐5条件下没有显著变化，在高盐50条件下Na+-K+-ATPaseα1基因表达量随时间积累呈现先降低后升高的变化趋势。在肠组织中，两基因存在极显著的协同作用，随着盐度的升高，两基因的表达量都呈现先升高后降低的趋势，且相关系数均接近于1；在鳃组织中，在盐度10-40区间内，两种基因的表达存在明显的拮抗作用，当PRL基因的表达量呈现升高（下降）趋势时，Na+-K+-ATPaseα1基因的表达量呈现下降（升高）趋势，且两基因的相关系数均为负值，证实了催乳素具有抑制Na+/K+-ATP酶活性的作用，为今后盐度胁迫分子调控机理研究提供理论依据。
　　利用高通量测序技术，通过对盐度50海水胁迫后和正常盐度的肾组织进行转录组测序，构建了大菱鲆幼鱼盐度相关的转录组数据库，全面了解大菱鲆盐度胁迫后基因的表达情况，筛选了与盐度相关的候选基因，鉴定了与盐度相关的代谢通路，检测到大量的分子标记，并对部分盐度基因进行荧光定量表达分析，得到的结果如下：
　　1.得到干净阅读子后拼接得到182225个unigenes，拼接得到的Unigenes可全部注释到7个数据库中。全部基因的功能聚类成43个GO范畴，聚类基因最多的依次是“细胞过程”，“连接”，“代谢过程”，“单一生物过程”；将KOG注释成功的基因按KOG的group进行分类，聚类基因最多的依次是“信号转导机制”，“一般功能”，“翻译修饰、蛋白转换、伴侣”；根据KEGG代谢通路进行分类，聚类基因最多的依次是“信号转导”、“内分泌系统”、“免疫系统”。
　　2.通过与其他鱼类代谢通路和基因功能分析，鉴定出与大菱鲆盐度相关的通路分别是：胆汁分泌，矿物质吸收，钙信号通路，收集管酸分泌；还鉴定出基因显著（P＜0.05）富集的通路有16个。
　　3.采用DESeq进行分析，筛选阈值为padj＜0.05，得到262个上调基因和506个下调基因，对比其他鱼类盐度转录组数据鉴定出59个与大菱鲆盐度相关的基因；既有与Cl-相关的基因，如：NACC2、PAT1、PRLR等；也有和Na+相关的基因，如：NHE-3、SGLT1、ASBT等；还有与H2O相关的基因，如：AQP1、AQP4、AQP8、CA等；还有和能量有关的基因，如，NKA、ATP6V1E1等；还有代谢相关的基因，如：CHST6、INO1、ANXA11、IDH2、ECH1、ECH8等；还有既与抗原处理相关又与应激相关的HSP70基因；还有既与生长相关又与渗透压调节相关的PRLR基因。
　　4、根据基因的作用以及前人的研究结果，选取10个基因进行荧光定量分析发现，除PAT1基因外等9个基因在低盐度（盐度5）胁迫下的肾中均有较高的表达；10个基因在肠中的表达量较少，尤其PAT1基因、APOC1基因、APOM基因、CALM基因、FABP6基因、HMDH基因等6个基因在肠中的表达量显著（P＜0.05）低于其他组织。
　　本文利用MISA软件对大菱鲆转录组中的182225条Unigenes序列进行搜索，共检测到81314个SSR位点，SSR发生频率为31.17％；EST-SSR的长度在12-20bp的有78247条，其中二核苷酸重复SSR最多，共计34783条；共检测到335种重复基元，其中以单核苷酸的A/T和二核苷酸的AC/GT最多，分别占总SSR的31.17%和31.05%。选择30对扩增引物中，共有3对EST-SSR引物表现出个体多态性，多态性比率为10%，SSR的等位基因数目为2个，平均有效基因数为1.8141，平均观测杂合度为0.5514，平均期望杂合度为0.4486，多态性信息含量分别为0.6897、0.6474、0.5713，平均为0.6361。
　　本研究利用本实验室前期筛选出特异性较好的151对微卫星标记对大菱鲆盐度性状展开研究。结合分群分离分析法，初步筛选出4个可以在正常盐度组和低盐胁迫组出现差异条带的微卫星位点，然后对4个微卫星位点进行单个样本的微卫星分析验证，应用SPSS软件分析，得到1个极显著（P＜0.01）相关位点，2个显著（P＜0.05）相关位点。

目录

声明

引言

第一章 文章综述

1盐度胁迫对鲆鲽鱼类的影响

2大菱鲆转录组研究进展

3大菱鲆遗传标记研究进展

第二章 大菱鲆(Scophthalmus maximus)PRL基因、Na+-K+-ATPaseα1基因对盐度胁迫的响应

1实验材料和方法

2 结果

3讨论

4结论

第三章 基于转录组数据的大菱鲆(Scophthalmus maximus)盐度相关功能基因的发掘和表达分析研究

1材料和方法

2 结果与分析

3讨论

4 结论

第四章 基于转录组数据的大菱鲆（Scophthalmus maximus）盐度相关微卫星标记的分析

1 材料和方法

2结果和分析

3讨论

4结论

第五章 基于BSA方法的大菱鲆盐度相关微卫星标记的筛选

1材料和方法

2结果

3 讨论

结论

参考文献

附录

致谢