斑节对虾JNK信号通路中的JNK、C-JUN和ATF-2基因的克隆与功能研究

摘要

斑节对虾（Penaeus monodon）占据水产养殖重要的地位，同时因斑节对虾所具有的较高的产量和良好的质量，个体大、生长快、肉质鲜美和营养丰富等优点深受人们的喜爱，所以斑节对虾的市场前景广阔。但是现在斑节对虾养殖业的发展深受病害的制约，病害的爆发致使斑节对虾养殖业遭受巨大的损失。所以为斑节对虾的病害防治而深入研究其免疫防御机理，进而探索一条新的免疫防治途径。本研究为免疫防御机制的研究奠定了基础。JNK信号通路中JNK、C-JUN和ATF-2基因均在不同的环境应激下激活，其中有渗透休克，紫外线辐射，热休克，氧化应激，细菌和病毒感染，并对蛋白质合成抑制剂，化疗剂，细胞死亡配体，免疫效应子和促炎细胞因子的合成和分泌起重要作用。在本研究中利用SMART-RACE技术克隆出斑节对虾免疫相关基因JNK信号通路中JNK、C-JUN和ATF-2基因c DNA全长序列。通过qRT-PCR法研究了它们对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌刺激下的表达模式，并结合 RNA干扰靶基因特异性沉默对JNK信号通路部分基因JNK、C-JUN和ATF-2基因及抗菌肽进行了关联分析。初步得到如下结果：
　　PmJNK序列全长2645bp，包含一个147bp的5′非编码区（UTR）、1235 bp的3′非编码区（3′UTR），和1263 bp的开放阅读框（Open reading frame，ORF），编码421个氨基酸的多肽，其理论相对分子量和理论等电点约为47.5 kDa和6.47。PmC-JUN序列全长1875bp包含一个134bp的5′非编码区（UTR）、844 bp的3′非编码区（3′UTR），和879 bp的开放阅读框（Open reading frame，ORF），编码293个氨基酸的多肽，其理论相对分子量和理论等电点约为32.58 kDa和7.79。PmATF-2序列全长2291bp包含一个312bp的5′非编码区（UTR）、398 bp的3′非编码区（3′UTR），和1581 bp的开放阅读框（Open reading frame，ORF），编码527个氨基酸的多肽，其理论相对分子量和理论等电点约为55.6 kDa和7.11。利用体外重组蛋白技术初步探究JNK信号通路部分基因JNK、C-JUN和ATF-2基因的蛋白在体外表达情况，体外重组蛋白的成功为今后深入探究JNK信号通路中JNK、C-JUN和ATF-2基因在斑节对虾免疫应答的调控功能奠定了基础。
　　在对斑节对虾模式分析的过程中发现，PmJNK mRNA的表达量在血淋巴和鰓中表达水平较高，PmC-JUN表达水平在鳃中最高，PmATF-2表达在鰓中表达水平最高。PmC-JUN和PmATF-2在肝胰腺和血淋巴组织表达水平略低。进一步沉默目的基因后 PmJNK在血淋巴中的基因沉默率低于肝胰腺和鰓。沉默目的基因JNK后，除目的基因JNK表达率下降外，同样发现下游的基因C-JUN和ATF-2也有一定的下降趋势，且C-JUN和ATF-2的表达水平明显低于基因JNK的表达水平，且C-JUN表达量低于ATF-2基因的表达量。分别沉默基因C-JUN和ATF-2，发现两基因在鰓中的沉默率高于肝胰腺和血淋巴。沉默基因C-JUN后，基因C-JUN表达率下降，但JNK和ATF-2并没有显著变化。沉默ATF-2后，ATF-2表达率下降，JNK和C-JUN却没有显著变化。结果表明，结果表明三个基因间的相互作用关系是通过上游JNK基因对下游C-JUN和ATF-2基因进行调控的。
　　在本研究中，使用qRT-PCR方法，在哈维弧菌和无乳链球菌感染后的斑节对虾血淋巴，肝胰腺和鳃中研究PmJNK的mRNA表达模式。结果发现，与对照组相比，哈维弧菌和无乳链球菌感染后PmJNK，PmC-JUN和PmATF-2 mRNA表达水在不同免疫组织不同时间刺激下均显著上调，并在细菌刺激下在血淋巴，肝胰腺和鳃组织中不同时间点内抗菌肽 AMP和 PEN的表达量明显上调。在哈维弧菌和无乳链球菌感染后通过原位杂交实验发现，与PBS对照组相比，PmJNK， PmC-JUN，PmATF-2阳性信号开始增加。结果表明，这些实验结果表明这些基因在斑节对虾免疫方面起重要作用。
　　在本研究中，使用 qRT-PCR方法，在哈维弧菌和无乳链球菌感染后在注射dsRNA-JNK，dsRNA-C-JUN，dsRNA-ATF-2进行基因沉默。处理过后对斑节对虾血淋巴，肝胰腺和鳃中JNK，C-JUN，ATF-2三个基因进行表达模式检测。结果表明，与对照组相比，哈维弧菌和无乳链球菌感染后PmJNK，PmC-JUN，PmATF-2表达水平均显著降低，且分别沉默JNK，C-JUN，ATF-2对其他两个基因有不同程度的影响，并且沉默JNK基因对C-JUN和ATF-2两个基因的影响比较明显。同时发现抗菌肽的表达量也显著降低。因此JNK信号通路部分效应因子可能参与到免疫调控的过程中。结果表明JNK、C-JUN、ATF-2基因在斑节对虾在抗菌机制中起重要作用，行使功能时是通过上游JNK调控下游C-JUN和ATF-2基因进行的。这些研究结果对深入了解斑节对虾的抗菌过程中的分子机理提供依据。

目录

声明

第一章 引 言

1.1 文献综述

1.2 斑节对虾病害防治与免疫的研究现状

1.3 JNK信号通路及部分基因研究现状

1.4 本研究的目的与意义

1.5 技术路线

第二章 JNK信号通路部分成员克隆表达及生物信息学分析

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第三章 JNK信号通路部分成员表达特征及模式分析

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

第四章 靶向JNK信号通路部分成员基因沉默后转录水平上的关联分析

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

第五章 细菌侵染后JNK信号通路部分成员的表达差异分析

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 实验结果

5.4 讨论

第六章 细菌刺激下沉默目的基因后的功能分析

6.1 实验材料

6.2 实验方法

6.3 实验结果

6.4 讨论

总结

参考文献

附录

致谢