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摘 要
本研究选取12对高多态性微卫星标记进行优化组合，构建了4组三重PCR体系，对短蛸4个母本、104个子
三、短蛸交配前后性选择机制研究
本研究首先选取36个成体短蛸进行形态测量并分析11个形态参数的相关性，结果发现短蛸的胴长、胴宽、8个
关键词： 短蛸，微卫星，亲权鉴定，交配模式，性选择
Development of microsatellite markers and studies
ABSTRACT
The normalized full-length library had a storage c
2.Development of microsatellite multiplex PCR sets a
In this study, 4 groups of triplex PCR sets were e
3.Study on sexual selection mechanism of A. fangsiao
We firstly measured eleven morphological parameter
KEY WORDS: Amphioctopus fangsiao, microsatellite,
第一章文献综述
除去载体序列、100bp以下的序列及低质量区域后，用Trinity软件[97]对获得的高质量的
2.1 总RNA，mRNA，cDNA文库的质量评估
2.2 基因片段的整合与功能注释
1.1实验材料
1.2实验仪器
在本章节实验所需要的主要仪器归纳如下表：
表 2-1 本实验所需仪器及设备信息
Table 2-1 information of instruments used in the
仪器
生产商
漩涡震荡器（Lab Dancer 3365025）
德国IKA公司
超纯水、CTAB、Na-Cl、Tris-HCl、EDTA-Na2、蛋白酶K、无水乙醇、TE缓冲液、1
表2-2 试剂配方
Tab.2-2 Reagent formulation.
试剂
配方
用量
CTAB
20g
NaCl
81.82g
1M Tris-HCl
100ml
0.5M EDTA
40ml
Tris
24.228g
EDTA
18.61g
80ml水溶解，NaOH(固体) 调PH至8.0，定容至100ml，高压蒸汽灭菌
242g
Na2 EDTA 2H2O
37.2g
冰醋酸
57.1ml
于800ml水中溶解，NaOH调PH至8.0，定容至1000ml
108g
硼酸
7.4g
纯水定容至1000ml
0.1% AgNO3
1g AgNO3固体加入1000ml水溶解
显色液
无水碳酸钠
0.4g
加500ml水溶解；10ml甲醛（显色时现加），定容至1000ml
10% APS
1g APS加入1000ml水溶解，4℃保存，有效期一周
在前期获得的cDNA序列中，使用SSRHunter软件筛选富含微卫星的序列，利用Primer Pre
1.4.2 基因组DNA的提取和检测
1.4.3 引物筛选及检测
1.4.3.1 PCR扩增体系及程序
1.4.3.2 PCR产物检测
1.4.4 数据统计分析
以10bp的DNA Marker为参考标准对目的条带判读，用软件POPGENE统计每个微卫星
1.4.5 近缘种中的通用性研究
从开发的119对多态性引物中随机选出43对引物，对金乌贼、长蛸、真蛸、卵蛸、日本无针乌贼各1
2 结果与讨论
经优化筛选后得到119个多态微卫星位点，所有位点在短蛸30个个体中进行扩增，经8%非变性聚丙烯
2.2 短蛸微卫星引物在近缘种中的通用性
微卫星的侧翼序列在同属不同种间和近源物种中间保守性较高，而且在亲缘关系较远的物种中也可能具有一定的通
Fig. 2-5 Partial results of PCR products a
表2-6 短蛸119个微卫星位点的多态性信息
Tab. 2-6 Levels of variability at 119 polymorphic
注：“+”表示有PCR扩增产物；“-”表示无扩增产物；这10各位点在至少一个物种中能成功扩增，其余位
Notes: “+” indicates PCR amplification; “-” indica
第三章短蛸微卫星多重PCR体系建立及交配模式分析
0 引言
交配期是头足类繁殖行为的重要时期，具有复杂的求偶、交配和繁殖策略[75]。目前有关短蛸人工育苗[6]
研究动物的交配模式最直观的方法是实地观察，但对于活性强的水生动物而言难度较大。而且，观察到多重交配行
本研究从开发的微卫星标记中，选择多态性高、特异性好、片段大小适中的位点进行优化组合，构建微卫星多重P
1 材料与方法
本研究所用亲体与幼体样品于2015年取自山东省海洋资源与环境研究院东营基地。首先将野生雄蛸和雌蛸于池
1.2实验仪器
1.3实验试剂
1.4实验方法
1.4.1短蛸基因组DNA的提取和检测
同本文第一章第二节1.4.2
1.4.2 微卫星多重PCR的设计和优化
在本研究开发的微卫星标记中，根据扩增条带清晰度、亮度及多态性选用12个位点，分别为DS140，DS1
利用构建的多重PCR体系分别对19个候选父本、4个母本及对应的104个幼蛸进行特异性扩增。多重PCR
1.4.3数据统计分析
用CERVUS 3.0进行亲子鉴定分析，母本已知，具体参数设置为19个候选父本，模拟子代数为1000
2 结果
12个位点经优化组合后得到4组三重PCR，三重PCR体系引物的位点组合、重复单元、碱基序列、产物大小
2.2 短蛸交配模式分析
利用4组三重PCR体系，使用CERVUS 3.0对四个母本、104个子代及19个候选父本进行亲权鉴定
3 讨论
微卫星以单一位点进行PCR扩增需要一定时间、成本。通过构建微卫星多重PCR进行各项遗传参数分析可节约
交配模式分析有助于全面了解水产动物复杂的繁殖行为，能为其人工繁育、增养殖、遗传育种及人工放流等多个方
本研究四组样品中父本♂2的后代比例分别高达71.43%（10/14）、60.98%（25/41）、8
第四章短蛸交配前后性选择机制研究
0 引言
性选择是雌雄个体间根据个体表型特征进行选择性交配的一种婚配现象[122]，包括交配前形态个体水平的选
性选择研究是繁殖行为学、进化生态学等领域中的研究热点，有关短蛸性选择的研究还尚未报道。受研究条件限制
1 材料与方法
1.4实验方法
1.4.1 形态参数测量及相关分析
对池中17个成雄蛸和19个雌蛸（共36）进行形态学测量，用数显电子游标卡尺测量总重、胴长、胴宽和腕长
1.4. 2 短蛸亲子鉴定
1.4.2.1 短蛸基因组DNA的提取和检测
同本文第一章第二节1.4.3.1
1.4.2.2 微卫星PCR特异性扩增
从开发的微卫星标记中挑选特异性好的14对引物DS152，DS220，DS132，DS280，DS31
1.4.2.3 数据统计分析
同本文第二章1.4.3
1.4.3 交配前后性选择研究
结合亲子鉴定结果，对参与交配（有子代）的雄蛸和未参与交配（无子代）的雄蛸进行总重、胴长、胴宽和腕
从线性方程可以看出：胴长，胴宽，八个腕长10个参数均随总重的增大而增大。
3 讨论
小结
本研究通过构建短蛸均一化全长cDNA文库，开发多态性微卫星标记，并对其在近缘物种中的通用性进行分析；
1、构建了质量良好的短蛸均一化全长cDNA文库，获得3440个ESTs，成功开发了119个多态性微卫
2、构建了4组三重PCR体系，对短蛸4个母本、104个子代及19个候选父本进行亲权鉴定，分析得出短蛸
3、选取14个多态性微卫星引物对3个母本、176个子代及17个候选父本进行亲权鉴定，进一步验证了短蛸
参考文献
科研成果
1.刘文芬, 冯艳微, 王卫军, 陈建强, 杨建敏, 2018. 短蛸微卫星多重PCR体系建立及交配模式
3.FENG Yanwei, LIU Wenfen, XU Xin, YANG Jianmin etc,
(Amphioctopus fangsiao) 微卫星多重PCR体系建立及交配模式分析”，并做口头
致谢
研究生三年随着致谢的完成就意味着画上句号，思绪万千、感恩经历。感谢杨老师把我带到这个分子实验室
在试验期间，我们实验室的同学都团结有爱、热情好学，创造出了很好的科研氛围，感谢我的同学刘阳、刘春廷、
最后谨向所有帮助过我、关心过我的老师、同学和朋友致以最诚挚的谢意，愿每个人都能平安健康！
