抗多种肿瘤抗体Fab及无连接肽单链抗体基因的克隆与表达

摘要

从培养的杂交瘤细胞中提取mRNA,通过逆转录PCR扩增得到抗体的重链可变区基因(V<,H>)和完整的κ轻链基因,并测定了轻、重链可变区基因的序列.对包涵体进行了变性及稀 释透析复性,经ELISA检测表明复性产物具有与亲代抗体相同的抗原结合特性.为了获得具 有多价结合活性及提高总的亲合力,研究人员在Fab表达质粒的基础上,构建了单链抗体基 因,为了使表达产物为单链抗体多聚体以提高单链抗体的总亲合力(Avidity),研究人员采 取了单链抗体轻重链直接相连的策略.用稀释透析复性及凝胶过滤层析复性两种复性方法对经盐酸胍溶解变性的的包涵体进行复性,经ELISA检测表明两种复性方法都得到了与亲代抗 体有相同的抗原结合特性的单链抗体,而且后一种复性方法效果显优于前一种方法.

目录

前言

材料

菌株、细胞系与质粒

培养基

主要工具酶及来源

主要生化试剂

抗体

寡核苷酸引物

试剂盒

主要仪器设备

计算机软件包

方法

杂交瘤细胞的细胞培养

常规分子生物学方法

表达产物胞内定位

表达产物的变性和复性

ELISA检测表达产物(Fab及scFv)的抗原结合活性

结果

SC3A Fab和SC11 Fab基因的构建及表达

mRNA模板的提取、纯度检测及定量

RT-PCR扩增重链可变区及κ轻链基因

Fab表达质粒的构建

重组质粒的酶切鉴定

SC3A、SC11轻重链可变区基因序列的测定

SC3A和SC11VH及VL序列的分析与比较

SC3A和SC11Fab的表达及活性测定

SC3A无连接肽单链抗体(zero-residue linker scFv)基因的构建及表达

轻重链可变区羧基末端氨基酸的确定

PCR扩增轻链基因可变区所用引物的设计

以SC3A、SC11Fab表达质粒为模板扩增轻链可变区基因

SC3A、SC11无连接肽单链抗体基因的构建

SC3A、SC11无连接肽单链抗体基因的表达及表达产物的活性检测

讨论

结论

致谢

参考文献

综述