重组病毒在敏感性烟草上引发的过敏性反应的研究

摘要

烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)是一种杆状的正义RNA病毒。野生型TMV可以系统地感染敏感烟草N.tabacm cv. Samsun nn并产生典型的花叶症状。然而，TMV外壳蛋白(coat protein，CP)末端融合外源小肽所构建的许多重组病毒中，如TMVFN20、TMVSc1754等能在Samsun nn的接种叶上引发类似于抗性烟草上的枯斑反应。 本实验室前期实验证明TMVFN20在敏感烟草上引发的枯斑反应是过敏性反应(Hypersensitlve response，HR)，表明了TMVFN20能够激活过敏性烟草的防卫性反应。同时也证明了HR的产生是重组CP在蛋白水平上引起的。为了寻找与重组CP蛋白相互作用的宿主蛋白，进而阐明敏感烟草上HR的诱发机制，本工作通过酵母双杂交方法用TMVFN20的外壳蛋白FN20CP作为诱饵从烟草酵母双杂交cDNA文库筛选与重组CP互作的蛋白因子，结果筛选得到三类阳性克隆，分别是烟草核糖体蛋白小亚基S29(Nicotiana tabacum Ribosomal Protein S29，NTRps29)、内几丁质酶(endochitinase)和碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase，CA）。为了进一步对候选蛋白因子进行深入研究，原核表达并得到了NTRps29和endochitinase的融合蛋白，免疫家兔制备了NTRps29和endochitinase的多克隆抗体。与病原物激发子互作的蛋白因子的获得以及对这些蛋白因子的进一步研究对阐述敏感性烟草上的这种非特异性的HR反应机制非常关键。 与TMVFN20不同，TMVSc1754是融合有含跨膜区小肽的重组病毒，而且与TMVFN20在敏感烟草上引发的枯斑在表型上有差异，因此我们又以TMVSc1754为例来研究重组病毒在敏感烟草上引发的枯斑反应。前期实验结果显示当TMVSc1754侵染敏感烟草Samsun nn时，防卫反应相关基因，如HIN1和HRS203J，以及PR1a和PR1b等的表达强烈上调，也证明了精胺(Spermine，Spm)信号通路参与了TMVSc1754诱导的敏感烟草上的枯斑反应。本部分工作首先通过枯斑组织代谢物的检测，说明了TMVSc1754引发的这种枯斑与抗性烟草上的HR枯斑类似，进一步说明TMVSc1754引发的敏感烟草上的枯斑反应是HR。 其次，TMVSc1754侵染敏感烟草时，Spm合成途径的关键酶ODC和SAMDC的表达强烈上调说明在TMVSc1754诱发HR枯斑过程中，Spm在体内大量积累，Spm合成抑制剂MGBG又能极大地抑制枯斑的形成。这些结果表明Spm作为信号分子在这种敏感烟草的HR信号转导中起了很重要的作用，同时说明TMVSc1754可以激活敏感性烟草的防卫反应。

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第一章文献综述

1.1植物抗病基因

1.1.1 R-avr基因互作

1.1.2抗病基因介导的信号传导

1.1.3抗病基因与HR的关系

1.2植物抗病反应的基本信号通路

1.2.1水杨酸信号传导通路

1.2.2乙烯和茉莉酸信号传导通路

1.2.3精胺信号传导通路

第二章 实验材料和方法

2.1实验材料

2.1.1烟草及培养条件

2.1.2菌株和质粒

2.1.3酶及试剂

2.1.4培养基

2.1.5 PCR引物

2.2实验方法

2.2.1酵母双杂交载体pGBKT7-FN20CP的构建

2.2.2大肠杆菌感受态细胞的制备和转化(热激和电击感受态细胞)

2.2.3酵母感受态细胞的制备

2.2.4酵母热激转化

2.2.5 pGBKT7-FN20CP对酵母菌株Y187毒性检测

2.2.6 BD-FN20CP融合蛋白的自激活排除

2.2.7酵母文库筛选及阳性质粒的获得和分析

2.2.8碱裂解法提取质粒

2.2.9酵母同转实验

2.2.10原核表达重组质粒的构建

2.2.11 IPTG诱导表达和菌体裂解

2.2.12镍柱纯化蛋白

2.2.13超滤法蛋白脱盐，浓缩处理(MILLIPORE 超滤管)

2.2.14蛋白定量(碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒)

2.2.15免疫家兔

2.2.16 SDS-PAGE

2.2.17 Western-Blotting印迹杂交

2.2.18酶联免疫吸附测定(ELISA)间接法

2.2.19 Protein A亲和层析柱纯化抗体

2.2.20体外转录

2.2.21 PTMV20，pTMVSc1754的体外转录产物接种烟草

2.2.22枯斑组织化学染色

2.2.23烟草叶片总RNA的提取

2.2.24 RNA的后处理

2.2.25 RT-PCR

第三章 实验结果与讨论

(一)FN20CP互作蛋白的筛选和鉴定，以及多克隆抗体的制备

3.1结果与分析

3.2讨论

(二) TMVSc1754在敏感烟草上引发枯斑反应的分析

3.3实验结果

3.4.讨论

第四章小结与展望

4.1结论

4.2展望

参考文献

作者在攻读硕士学位期间公开发表的论文

致谢