一种高通量定量检测细胞凋亡方法的建立和初步应用

摘要

动物细胞大规模培养技术是目前生物技术制药产业广泛采用的技术平台,细胞凋亡的发生是培养中限制产量和增加成本的主要环节,预防并控制凋亡也因此成为研究的热点.进行凋亡控制的重要前提是对其进行早期检测.该研究以杂交瘤细胞G7为研究对象,用DNA交联染料YO-PRO-1(简称YP)联合PI对细胞进行染色,活细胞、凋亡细胞和坏死细胞因膜通诱性的差异而着染为不同的颜色,从而将三者区分开来.分别借助荧光显微镜和流式细胞仪检测YP/PI染色的细胞凋亡情况,将其检测结果与公认较为准确的AV/PI流式细胞仪方法进行比较,表明前两者与后者有显著的相关性,并且没有显著差异,因此可以用YP/PI染色的方法代替AV/PI流式法检测细胞凋亡.在此基础上,证明实了经染色的细胞YP/PI荧光强度与凋亡/坏死细胞数具有显著的相关性,因而可以通过检测YP/PI荧光强度定量凋亡/坏死细胞数.该研究优化了荧光分光光度计检测所需的各种条件,在96孔细胞培养板中,使用3μMYP,4μg/ml PI,于37℃孵育8min,用Ex/Em为485/538和530/590两组滤光片分别检测YP和PI的荧光强度.结合细胞密度的计数结果(细胞计数板、MTT比色法等),建立了用YP、PI荧光强度值计算细胞凋亡和坏死百分数的方法.实验证实,该方法可检测出样品中少至100个的凋亡细胞,具有很高的灵敏度;检测在96孔板中即可进行,操作简便,快速省时,因而适于高通量应用.将该方法应用于寻找培养体系中的诱导细胞凋亡的主要因素和筛选有效的抗凋亡药物方面,结果证明培养体系中葡萄糖、胱氨酸、谷氨酰胺等营养成分的缺乏,pH降低等因素能够诱导G7细胞发生凋亡.通过筛选几种化学药物,证实了在无gln和无葡萄糖两种情况下,caspases抑制剂Z-VAD-FMK均能够有效的抑制细胞凋亡的发生,是一种有应用前景的抗凋亡药物.用低剂量的Staurosporine处理半贴壁培养、呈球形的G7细胞,在不明显影响细胞活力的条件下,可引起细胞发生伸展变形,成为类似成纤维细胞的形状.检测了该现象所伴随的细胞生长代谢及细胞周期分布的变化,但其具体机理仍有待进一步阐明.

目录

前言

第一部分YP/PI染色检测细胞凋亡的方法的建立

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

实验结果

讨论

第二部分确定培养体系中诱导凋亡的主要因素和筛选有效的抗凋亡药物

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

实验结果

讨论

第三部分STS处理对G7细胞生长代谢的影响

材料与方法

1实验材料

2 实验方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述 动物细胞大规模培养过程中细胞凋亡的检测与控制

致谢