人脂联素基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效可溶性表达

摘要

脂联素(adiponectin)是一种与肥胖、胰岛素抵抗、Ⅱ型糖尿病及心血管疾病密切相关、具有多样生物学调节功能的特异脂肪细胞因子，潜在的应用价值十分巨大。目前，国外有许多研究人员致力于研究各种生物来源的脂联素性质和功能，但在国内相关的报道还较为少见。 在本研究中，首先以人血液基因组总DNA为模板，独特地利用引物重叠延伸法，扩增并合并脂联素两个外显子片段的编码序列，得到了全长的、经测序验证准确的人脂联素基因(AP)。将AP基因以融合表达形式克隆到大肠杆菌载体pET-32a(+)中，成功构建了表达载体pET-wAP。在IPTG诱导下，硫氧还蛋白—脂联素融合蛋白获得了高效表达，达细菌蛋白总量的41％以上，但重组蛋白主要以包涵体形式存在。 为了使人脂联素能获得高效可溶性表达，本研究对其融合表达载体进行了不断的优化。第一步，将人脂联素基因(AP)与含His6的标签序列EC融合，构建pECAP表达载体，在IPTG诱导下，此ECAP融合蛋白占总蛋白的32.5％，在其所表达的可溶性蛋白中，此融合蛋白占总蛋白的17.5％。第二步，为了进一步增加目的蛋白的可溶性，加入高度可溶的NusA基因，构建pNuECAP表达载体，在IPTG诱导下，此NuECAP融合蛋白占总蛋白的39.5％，在其所表达的可溶性蛋白中，此融合蛋白占总蛋白的30.7％，但由于NusA蛋白本身较大，融合蛋白中脂联素蛋白的净含量则会相应减少。第三步，加入红素氧还蛋白(Tm)基因，构建pTmECAP表达载体，在IPTG诱导下，此TmECAP融合蛋白占总蛋白的33.4％，在其所表达的可溶性蛋白中，此融合蛋白占总蛋白的30.2％。至此，融合蛋白的可溶性得到很大提高，而且红素氧还蛋白(Tm)显示红色且分子量很小，从而脂联素蛋白的可溶表达量大大提高而且可以肉眼进行观察。 由于表达的融合蛋白都带有六聚组氨酸，利用六聚组氨酸与镍离子具有的亲和作用，只需经过一步亲和层析就能将目的融合蛋白从众多的蛋白组分中分离出来，非常方便、快捷。 综上所述，本研究成功地在大肠杆菌中高效、高可溶地表达了成熟的人脂联素蛋白，并通过亲和层析纯化了融合蛋白，从而为其进一步的功能基础研究和实际应用做好了准备。 本研究的特点和创新之处在于：1)直接以人基因组总DNA为模板，而不是通过反转录PCR或从cDNA文库扩增，以外显子体外拼接方式获得全长脂联素基因编码序列。2)利用不同优化表达策略有效提高了脂联素融合蛋白的可溶性，并最终获得了以红素氧还蛋白为融合表达标签的、高可溶性的脂联素融合蛋白。同时，红素氧还蛋白自身显红色及分子量小的优势，不但大大方便于融合蛋白表达的可视性监测，而且有助于目的蛋白的净表达量大为提高。

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综述

材料和方法

结果与分析

讨论

参考文献

附录

致谢