魏氏拟尾柱虫微管类细胞骨架的研究

摘要

细胞骨架尤其是微管类细胞骨架的研究是当前生物学最活跃的领域之一。原生动物纤毛虫含有复杂的微管骨架，其在纤毛虫非分裂时期对细胞形态及功能的维持具有重要作用，在无性分裂和一定条件下发生的生理改组过程中则经历分化和去分化的过程。研究纤毛虫的微管类细胞骨架对于揭示真核细胞的结构、功能及其细胞模式形成机理具有重要的理论意义，这已成为原生动物细胞学领域的重要内容。长期以来，对纤毛虫细胞骨架的研究仅局限于少数纤毛虫皮层的某一部位或是某些纤毛器的局部骨架上，且并非专门针对微管结构。为了解腹毛目纤毛虫在无性分裂及生理改组过程中微管类细胞骨架的演化特征和微管蛋白的定位、分布及流向，探索纤毛虫细胞在不同水平的调控，本文以腹毛目纤毛虫魏氏拟尾柱虫(Paraurostyla weissei)为材料，采用扫描电镜术、直接荧光标记、间接免疫荧光技术对不同时期纤毛虫细胞的微管类细胞骨架进行了标记和定位，并采用SDS-PAGE电泳的方法对其蛋白组分进行了初步分析。结果如下： 1、皮层纤毛器的形态及发生 扫描电镜术显示：魏氏拟尾柱虫腹面纤毛器按照口围带-波动膜-额腹横棘毛-左、右缘棘毛的模式排列，背面具有六列背触毛。无性生殖过程中，前仔虫口围带翻领部后端部分更新，原位形成口围带原基；后仔虫口围带原基于老的口围带及横棘毛之间产生；在新老口围带右侧形成波动膜及额腹横棘毛原基，原基经生长纤毛、分段、迁移最终取代老的纤毛器；左、右缘棘毛列前端和中部部分棘毛瓦解，在瓦解部位形成新的缘棘毛原基，原基生长纤毛，于老的棘毛列右侧延伸、分段、迁移最终分化为新的缘棘毛；背触毛的发生是背部形成两组原基，每组三列，原基生长纤毛并向后端延伸，在此过程中第三列原基分段形成两列背触毛，此外，在新的右缘棘毛右侧形成两列原基，经过生长纤毛、分段并逐渐向背部迁移最终分化为两列背触毛；原基向后端延伸中，后端部分原基形成尾棘毛。生理改组期，其纤毛模式演化特征类似于无性生殖期前仔虫，但口围带发生部分更新，更新模式与前仔虫有区别。无性生殖期和生理改组过程老的纤毛器对于新的纤毛器的形成皆有模板或者物质贡献作用。 2、 微管胞器形态及发生的直接荧光标记 荧光紫杉醇直接荧光标记显示，拟尾柱虫腹面皮层微管胞器由口围带、波动膜、额腹横棘毛和左右缘棘毛等纤毛器微管、纤毛器基部附属微管等组成。口围带基部具横梁状小膜托架；额腹横棘毛和左右缘棘毛基部附属微管包括前纵微管束、后纵微管束和横微管束，它们由各自的纤毛器基部向皮层细胞质不同方向发射，形成腹皮层表面下微管网。其中缘棘毛基部附属微管具有不同于棘尾虫中所观察到的同种微管胞器的建构特征。形态发生中，前仔虫口围带在老结构位置形成，其结构建成与部分老口围带的更新有关；老缘棘毛的结构物质对新的左、右缘棘毛的发生可能具有定位作用及物质贡献，但此后新的左、右缘棘毛列分别在老缘棘毛的右侧形成，而并非是在老缘棘毛位置分化的。在有些细胞中，新的左缘棘毛左侧另有一列棘毛，这可能是形态发生中老的左缘棘毛退化不完全产生的。生理改组期其纤毛器演化模式类似于无性分裂期前仔虫，不同之处是改组后细胞最终形成一套纤毛器，此外其口围带领部后端部分发生更新过程中，在其残余的口围带与新形成的口围带之间有明显的断裂面，随着生理改组的进行而被新形成的小膜填补完整。总结微管类细胞骨架在无性分裂及生理改组过程中的演化特征，推测微管胞器在生命活动的不同时期及不同生理条件下发生连续的变化，是细胞生命活动中极为重要的结构，并且先存结构对于新结构的形成除了有物质贡献，还具有结构诱导和模式定位的作用。 3、微管胞器的α-微管蛋白免疫荧光标记和定位 应用抗α-微管蛋白抗体标记显示，拟尾柱虫细胞皮层的纤毛器、纤毛基体及基体附属微管束皆有明显的荧光反应。在口围带前端小膜基部首次观察到有两束较细的微管束，与相邻小膜附属微管束相互交叉呈“V”字形；横棘毛基部除具有前纵微管聚集形成的三角形微管层外，向后亦发出较为发达的后纵微管束；此外荧光结果显示拟尾柱虫的背部具有六列长短不均的背触毛列，细胞尾端着生有几根较为发达的尾棘毛。在无性分裂及生理改组期，除了获得与FLUTAX法一致的微管胞器演化特征之外，还观察到老的纤毛器基部微管束随着老结构的瓦解而按照由左至右的次序消失，由此推断魏氏拟尾柱虫腹面纤毛器亦按照由左至右的顺序发生。无性分裂期背触毛的发生大致为在细胞赤道面两侧各出现一组原基，原基生长纤毛并向后端延伸取代旧的背触毛，同时后端部分纤毛原基特化形成尾棘毛。这些结果表明在魏氏拟尾柱虫的皮层细胞骨架中，除表膜下微管和纤毛器微管外，纤毛器骨架、纤毛器附属结构等骨架均是一类以微管蛋白为基本成分的微管胞器；作为微管主要成分的α-微管蛋白存在于细胞纤毛器的整体结构中，在细胞不同的生命周期中稳定表达，且随无性生殖及生理改组期老结构的瓦解参与到新微管胞器原基的形成中。 4、细胞蛋白组分的初步分析 本研究利用SDS—PAGE电泳对魏氏拟尾柱虫的全蛋白、细胞骨架蛋白及去除微管蛋白的细胞骨架蛋白进行比较。结果显示：微管蛋白在全蛋白及细胞骨架蛋白中皆有较高量的表达，细胞骨架与全蛋白有较多的共享条带，且共享条带的蛋白丰度皆高于其他蛋白条带，表明纤毛虫原生动物细胞中细胞骨架较为发达，且微管类细胞骨架是主要的结构成分。去除微管蛋白后其细胞骨架蛋白在66KD左右各有一条残余条带，很可能与细胞形态的保持及细胞骨架的稳定性有关。 结论：本研究采用扫描电镜术及特异性显示纤毛虫微管与微管蛋白的方法，对魏氏拟尾柱虫表面纤毛器、细胞内微管类胞器及其附属微管的组成和分布特征及发生规律进行了较系统的观察，较详细地揭示了魏氏拟尾柱虫微管类细胞骨架的组成和模式。所得结果不仅有助于深入了解纤毛虫细胞微管骨架的组成特征，也为探讨真核细胞的细胞模式和模式形成以及微管类结构在真核生物中的进化和分化的规律提供深入研究的基础；此外，本文利用SDS—PAGE技术对魏氏拟尾柱虫的全蛋白、细胞骨架蛋白及去除微管蛋白的细胞骨架蛋白进行比较，对一些未知蛋白在细胞形态及细胞骨架稳定性保持方面的作用做了初步的探讨，对于其具体的功能值得进一步的研究。

目录

文摘

英文文摘

学位论文独创性声明及授权使用声明

第一章 原生动物微管类细胞骨架的研究

1 原生动物细胞骨架的类型和功能

2 皮层微管类细胞骨架的研究

3 研究展望

第二章魏氏拟尾柱虫皮层纤毛器的形态及发生的扫描电镜观察

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

图版与说明

第三章FLUTAX跟踪标记魏氏拟尾柱虫微管胞器的形态及其发生

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

图版与说明

第四章免疫荧光方法对魏氏拟尾柱虫微管胞器的标记

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

图版与说明

第五章魏氏拟尾柱虫蛋白组分的初步分析

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

4 下一步工作

参考文献

在攻读硕士期间参加得科研项目及撰写的论文

致谢