中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）精荚破裂以及精子顶体酶活力研究

摘要

本文根据目前我国中华绒螯蟹养殖经济中的繁育质量问题和国内外对动物生殖系统的研究情况，围绕精荚变成精子的过程，对该蟹雌体纳精囊，雄体副性腺以及精子顶体酶活力进行必要的研究。一方面从科研的角度来为进一步研究甲壳动物生殖系统提供资料；另一方面，也为我国淡水经济资源能得到更好的发展提供基本理论依据。 1、纳精囊是中华绒螯蟹雌性生殖系统的重要组成部分，在精子储藏、排卵以及受精过程中起着十分重要的作用。利用组织学，组织化学以及透射电子显微镜技术，对中华绒螯蟹成熟雌体纳精囊进行初步研究，以了解纳精囊壁的结构及所含主要化学物质。 纳精囊由囊壁和囊腔两大部分组成，囊壁由外至内分别为：结缔组织、肌肉层(局部有)、基膜和柱状上皮细胞(顶分泌型腺细胞)几个大的部分。但并非纳精囊壁的所有地方都按此顺序拥有所有的结构，有的只有一个或两个部分，中华绒螯蟹纳精囊壁属于典型的移行上皮。 透射电镜结果表明：纳精囊壁的柱状上皮细胞向腔内伸出很多微绒毛，纳精囊腔内具有多种不同类型的分泌物，它们在生殖过程中起不同的作用。 组织化学结果显示纳精囊壁分泌型细胞含有大量的糖类物质、一些蛋白质和脂类物质，其糖类物质分泌量明显多于其它的各种细胞。精子在进入纳精囊后其保持新陈代谢的能量由纳精囊上皮细胞分泌物提供。由此可推测，顶分泌细胞分泌的碳水化合物是精子在纳精囊中主要能量来源，而上皮细胞分泌物中的蛋白质和脂类物质可能参与精子自身的酶反应和其他一些反应。 2、中华绒螯蟹精子从前输精管开始以精荚形式存在，经过输精管(vasa deferentia)、储精囊和射精管(部分精荚经过副性腺)，随精液和雄性腺分泌液一起进入雌体纳精囊中。精荚进入到雌体纳精囊后，很快便破裂，释放出游离精子，以该形式存在直至与雌性卵结合，接着雌蟹抱卵。但是关于精荚的破裂机制至今都没有证据充足的结论。本实验旨在找到精荚破裂的场所和物质。 基于此，取中华绒螯蟹精荚，人工海水冲洗，使精荚浓度为1500个/ml左右。取精液以及副性腺，卵巢和纳精囊三种生殖器官，分别匀浆，冷冻离心提取蛋白，考马斯亮蓝法检测并平衡蛋白浓度。在同一条件下设立空白对照组，精液组，副性腺蛋白组，卵巢蛋白组和纳精囊蛋白组。各组分别加入到精荚中。载玻片取30微升混合液，显微镜下计数剩余完整精荚数量，在第5min，10min，20min，40min，60min和90min分别计数。 结果显示，对照组，精液，卵巢蛋白和纳精囊蛋白均对精荚破裂无影响，而副性腺蛋白可以使精荚显著破裂。由此可知：副性腺蛋白在精荚破裂中起重要作用。 3、已经验证中华绒螯蟹副性腺蛋白对精荚破裂有促进作用。中华绒螯蟹雄体副性腺位于储精囊和射精管交界处，与储精囊和射精管相通，并且在蟹体两侧对称分布，白色，呈发达分枝状盲管。 本试验在证明中华绒螯蟹副性腺蛋白有助于精荚破裂的基础上，通过扫描电子显微镜技术以及蛋白质电泳技术，进一步研究探讨副性腺中使精荚破裂的具体副性腺蛋白来源种类以及所处位置等。 扫描电子显微镜样品消化精荚证明副性腺中含有能使精荚破裂的蛋白，但平时并不分泌到副性腺腔中；扫描电镜结果表明：副性腺自溶物与完整内容物相比，大泡变小，形状由规则变为不规则，小泡数量明显增多。蛋白质电泳结果表明，副性腺自溶物中的小泡蛋白条带数量明显比大泡和对照增多几条，则可以证明：能够使精荚破裂的就是副性腺自溶物蛋白中的小泡蛋白。 4、精子顶体酶是精子顶体部一种特殊的酶，为丝氨酸蛋白酶，是受精过程中的一种重要的蛋白水解酶。此酶能水解卵细胞的透明带，使得精卵能相互融合。顶体酶还能够促进生殖系统中的激肽的释放，后者能够增强精子的活力和促进精子的运动。 经离体实验证明：纳精囊蛋白不能够使精荚破裂，而副性腺分泌物能够使精荚在较短时间内破裂。本文采用Kennedy方法，适当加以调整，来检测副性腺蛋白消化精荚后得到的游离精子和雌蟹纳精囊内的精子的顶体酶活力区别，由此进一步分析副性腺蛋白的作用和中华绒螯蟹精子顶体酶活力与其它物种精子顶体酶活力的区别。 经副性腺消化精荚所得的精子，顶体酶活力分别是3.216μIU·10<'-6>和2.232μIU·10<'-6>，显著低于雌蟹纳精囊中的精子顶体酶活力：239.090μIU·10<'-6>和219.297μIU·10<'-6>，证明：中华绒螯蟹副性腺蛋白尽管能使精荚破裂，但是和精子顶体酶活力增高关系不大。影响精子顶体酶活力的物质应该来自于雌蟹纳精囊内，实验中的扫描电子显微镜照片证明纳精囊内分泌物丰富，以及组织化学证明纳精囊分泌细胞分泌丰富物质，推测纳精囊内这些内容物可能会对精子顶体酶活力的提高起到作用。

目录

文摘

英文文摘

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第一章概述

第一节纳精囊的结构功能

第二节精荚破裂

第三节精子顶体酶活力

第四节本研究的目的意义

第二章中华绒螯蟹纳精囊的组织学，组织化学和超微结构研究

1、材料与方法

2、结果

3讨论

图版及图版说明

第三章中华绒鳌蟹精荚破裂的研究

第一节精荚破裂机制的初步研究

1材料与方法

2.结果

3讨论

第二节副性腺蛋白与精荚破裂中的作用

1.材料和方法

2结果

3讨论

图版及图版说明

第四章中华绒螯蟹精子顶体酶活力的研究

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

致谢