霍山蹦蝗和意大利蝗全线粒体基因组的测序及分析

摘要

线粒体DNA自上世纪70年代以来被广泛用于研究群体遗传结构，谱系地理学(phylogeography)和各种分类学水平上的系统发育关系研究。DNA测序技术的发展使得测定大量分类单元线粒体全基因组的工作成为现实，目前已测定全线粒体基因组序列的后生动物有745种，其中昆虫纲49种，但直翅目昆虫只有非洲飞蝗(Locustamigratoria)和东方蝼蛄(Gryllotalpaorientalis)被测序。因此为了更加清楚的研究昆虫线粒体基因组的差异及进化，急需对更多的直翅目昆虫全线粒体基因组序列进行测序和分析。 为了探索直翅目斑腿蝗科昆虫线粒体基因组的进化特征，本研究采用基于长PCR的二次PCR策略，结合克隆测序方法，对直翅目斑腿蝗科的两种代表昆虫霍山蹦蝗(Sinopodismahoushana)和意大利蝗(Calliptamusitalicus)全线粒体基因组进行测序和组装。分析了它们线粒体基因组的基因和蛋白质组成、同义密码子差异、tRNA和rRNA结构等多层次信息，并联合GenBank收录的六足总纲全线粒体基因组数据对系统发育关系进行重建。得到以下主要结论： 1.采用了基于长PCR技术的二次PCR测序策略，解决了昆虫肌肉组织线粒体纯化的困难，并避免了假基因的干扰。通过结合克隆测序方法，降低了实验难度，提高了该策略的通用性和稳定性，从而建立起一套快速、精确地进行昆虫全线粒体基因组测序的实验体系。 2.设计出了一套直翅目昆虫全线粒体基因组扩增的通用引物，并成功地应用到2种蝗虫的线粒体基因组测序中。 3.霍山蹦蝗和意大利蝗线粒体全基因组长度分别为15818bp和15667bp，存在很强的碱基AT组成偏向性。2个线粒体基因组均包含13种蛋白质基因、22种tRNA基因和2种rRNA基因，srRNA与tRNAlle基因间存在AT富含区。 4.两种蝗虫线粒体在基因顺序上与飞蝗相同，tRNAAsP(D)和tRNALys(K)基因顺序与包括蝼蛄在内的多数昆虫线粒体基因顺序存在倒置，而与蜜蜂相同。这种现象暗示相同的基因重排现象不一定具有同源性。 5.两种蝗虫线粒体蛋白质基因都使用了ATN作为起始密码子，而COI基因均使用了正常的ATC三联起始密码子，未出现飞蝗以ATTA作为起始密码子的情况。两种蝗虫除分别存在3个和2个不完整的TA或T外，都以TAA或TAG作为终止密码子。 6.两种蝗虫线粒体氨基酸和密码子的使用都具有强烈的偏向性。存在tRNA反密码子与高频率同义密码子不能严格匹配的现象，多数可通过GU配对来解决，tRNA(K)和tRNA(M)则通过反密码子第1位c的修饰以实现CA间不严格配对。 7.两种蝗虫线粒体tRNA的二级结构多数为典型的三叶草形结构，但tRNASer(AGN)均缺失DHU臂。霍山蹦蝗最短的tRNAPro可变环和TψC臂合并为10bp的臂环结构，而意大利蝗tRNAPro则具完整结构。它们的tRNASer(AGN)具有同分异构现象，推断这种现象能够在线粒体中存在并影响tRNA对密码子识别。对两种蝗虫lrRNA第Ⅳ、Ⅴ结构域的空间结构的预测显示它们与飞蝗之间变化较小。 8.只有霍山蹦蝗线粒体AT富含区存在与飞蝗类似的两段紧密相连的重复序列。说明该重复结构并不是蝗亚目的共同特征，暗示该重复序列是蝗亚目在进化中产生的衍征，而部分种类在进化中又可能将其丢失。 9.联合部分六足类动物的12种线粒体蛋白质序列重建的系统发育树显示，斑腿蝗科与蝗亚目均具有明显的单系性，除半翅目外六足类各阶元的分类关系与形态学观点基本一致。 该项研究受到国家自然科学基金资助，首次从比较及进化基因组学角度对斑腿蝗科两种昆虫的线粒体基因组进行详细的研究，为理解线粒体基因组结构和序列进化提供重要线索和数据，也为用完整线粒体基因组序列大规模研究直翅目高级阶元及六足总纲各目之间的系统发育关系奠定了基础。借助成功设计的一套通用引物，建立起对直翅目昆虫全线粒体测序工作的实验平台，为尽早实现从全线粒体基因组水平完整研究直翅目系统发育关系提供重要保证。本论文所发现的tRNAser同分异构现象，作为一种新的假说对线粒体分子功能与进化研究是一种补充。因此，该论文在比较及进化基因组学、分子进化和分子系统学领域将具有重要的实践价值和理论意义。

目录

文摘

英文文摘

学位论文独创性声明及学位论文使用授权声明

第一部分前言

第二部分材料与方法

第三部分结果分析与讨论

1线粒体基因组研究方法

2序列组装

3全线粒体基因组的结构和组成分析

3.1全线粒体基因组的基本情况

3.2蛋白质基因和密码子组成分析

3.3 tRNA注释结果及结构预测

3.4 tRNA Ser(AGN)异构体的探讨

3.5 rRNA注释结果及结构预测

3.6 AT富含区(A+T-Rich Region)及重复序列

3.7部分六足类全线粒体基因组联合数据的系统发育分析

第四部分结论

参考文献

附录：部分测序荧光峰图举例

致谢

攻读学位期间发表论文