抗HBsAg抗体在CHO细胞中表达量提高研究——抗体基因自身因素对表达量影响探索

摘要

基因工程抗体由于其特异性强、副作用低等特点在临床上将发挥越来越重要的作用，如应用于抗癌、免疫相关疾病等治疗。据统计在2010年前将有超过100种抗体应用于临床。抗体工程研究中有两个难点：一是抗体的人源化，以解决影响抗体的HAMA问题；二是抗体的大规模表达，即生产足够量的抗体以供临床应用。随着抗体工程研究的深入，前者已经不成问题，如利用Xenogene小鼠可以产生高度特异的完全人源性单克隆抗体；而后者却因为对真核细胞复杂的表达调控机制认识不充分而存在困难，目前由细胞工程生产的抗体价格昂贵(平均US$200/100mg)，影响其应用，所以如何提高抗体的表达量，降低成本，是当前迫切的要求。 影响抗体表达量的因素从总体上来看主要有三个方面，即抗体表达载体构建、宿主细胞选择和改造、细胞规模培养和生产工艺。其中表达载体构建是核心技术，包括通用载体的构建和对抗体基因本身的优化。本室以往的研究已经对基于CHO/dhfr-的表达系统进行了比较深入的研究，例如构建了一系列行之有效的蛋白质表达载体。本研究利用本室现有的抗HBsAg抗体作为模型蛋白，对影响抗体表达量的抗体基因自身因素进行分析，以供抗体表达系统构建时抗体基因设计提供参考。 首先采用仓鼠的密码子偏性对轻链基因进行改造，目的是解决在翻译过程中因CHO细胞中稀有密码子产生的蛋白质合成速度瓶颈。在设计了去除稀有密码子的轻链基因序列后，用合成寡核苷酸序列的方法，PCR拼接合成了优化的轻链序列，并且构建了其真核表达载体，采用和克隆于高效表达载体的重链基因共转染的方法，在CHO细胞中表达。结果表明，瞬时表达和克隆化细胞表达时优化后序列和原序列差异不显著，说明抗体在较低水平(表达蛋白量占细胞总蛋白质量的0.1-0.5％)表达时，稀有密码子的利用度还不构成蛋白质合成的瓶颈。由于异源蛋白在大肠杆菌和酵母细胞中表达时，稀有密码子的改造能大幅度提升表达量，以及有CHO细胞表达EPO(促红细胞生产素)人源性优化密码子后表达量提高的先例，所以我们估计，在抗体表达量达到一定比例后，密码子优化的抗体序列才能有效地发挥作用。 其次，根据资料选择和克隆了3种高效的信号肽序列，包括仓鼠β-酪蛋白信号肽序列(+接头序列)、杆状病毒p67蛋白信号肽序列、并对原有轻链信号肽序列进行了优化。把各种信号肽序列替换了原信号肽序列后，转染CHO细胞进行表达，结果其中原有轻链信号肽优化的抗体表达量最高，比原轻链表达载体提高4倍以上，含仓鼠β-酪蛋白信号肽序列的轻链表达载体提高约2倍，p67蛋白信号肽在稳定表达的细胞克隆上也有显著提高。这些结果说明，其它类型的蛋白质信号肽序列可以用于抗体表达，并且无须接头序列，我们的实验表明接头序列反而影响抗体的表达；还显示不同的信号肽序列对蛋白质的表达效率影响不同。其中原信号肽基因序列改造后产生的影响可能来源于对翻译效率的改善，因为其信号肽多肽序列并未改变。 由于抗体基因组序列中包含抗体蛋白质表达调控元件，所以在第三部分研究中构建了抗HBsAg抗体基因组序列。分别克隆了重链Fc段基因组序列(包括3'UTR序列)、J/CH杂合内含子序列等，并与抗体可变区序列一起克隆到pcDNA3.1中构建表达载体；同样，克隆了轻链J/Cκ杂合内含子和3’UTR序列，并把他们融合到原轻链cDNA序列中构建了真核表达载体。转染CHO细胞后表达结果表明，轻链和重链的基因组序列能够正确剪切，瞬时表达时基因组序列的改善不显著，但稳定表达克隆中轻链基因组序列比cDNA序列表达效果显著提高。说明基因组序列能改善抗体的表达效果，并且此作用不仅是改善了mRNA剪接步骤所致，而更可能是其中的非编码序列参与表达调控的结果。所构建的基因组表达载体，可以作为通用的嵌合抗体基因组表达载体，已经在多个嵌合抗体表达载体构建中使用。 抗体基因5’末端非翻译区序列也影响其表达，其中研究得比较清楚的是KOZAK序列，这在原表达载体中已经加入。有资料表明其余5'UTR部分对蛋白质表达也有影响。为了选择抗体表达载体的5'UTR序列，克隆了具有翻译增强作用的hHsp70基因5'-UTR序列，分别插入到抗体轻、重链基因的上游，构建表达载体，在CHO细胞中表达，结果表明，此序列能使重链表达提高约1倍，但对轻链的表达作用不显著。 其它方面，还构建了用于评价抗体基因和表达元件的Flp-In-CHO/pcDNA5FRT-IRES双表达载体，由于此载体能在特定CHO细胞中以单拷贝方式定点整合到高表达位点，所以能对不同序列抗体之间的表达量差异进行更精确的评价，用于构建抗体基因表达载体时选择合适的序列，实验结果显示，该系统表达HBsAg的表达量在每一个稳定表达克隆之间差异不超过40％。此外还进行了围绕EF1A启动子的LCR位点分析，克隆了部分相关基因序列，以待今后用于构建基于EF1A-LCR的高效抗体表达载体。 综上所述，本研究比较系统地研究了抗体本身序列方面的因素对抗体表达量的影响，为今后抗体的高效表达积累了经验和基础。

目录

前 言

第一部分抗HBsAg抗体密码子偏性优化和表达

第二部分信号肽对CH0细胞表达抗HBsAg抗体的影响

第三部分翻译增强子对抗HBsAg抗体表达的作用

第四部分抗HBsAg抗体基因组序列克隆和表达载体构建

第五部分有关抗体表达载体的其它改进

结论

参考文献

综述： 哺乳动物细胞生产抗体的产量影响因素及对策

致谢

附录：密码子优化器程序设计：