HIV-1 Nef基因的克隆、表达及其核酸疫苗的实验免疫研究

摘要

艾滋病病毒l型(HIV-1)属于单股正链核糖核酸(RNA)逆转录病毒。该病毒因具有高突变率、高重组率和高复制率等特点，故其基因组能快速变异，产生大量变异株，从而顺利逃脱宿主的免疫压力，致使HIV感染者/艾滋病(HIV/AIDS)患者总数日趋增多。
　　 Nef（负因子）是一种N-末端豆蔻酰化蛋白质。尽管Nef对于病毒的体外复制是非必需的，但它在HIV-1体内致病中发挥作用。自从nef基凶被成功克隆后，数以千计的关于Nef功能的论文已发表，这些发现确定了Nef的四个主要功能：(1)调节细胞表面分子的表达量，(2)增强病毒感染力，(3)干扰细胞信号传导，(4)操控细胞凋亡机制。虽然这些发现的生物学相关性有待于进一步确认，但它提示了Nef的体外功能和HIV-I在体内致病性之间的相关性。
　　 在多种病毒性疾病的动物模型上已经证实核酸疫苗可以诱导产牛体液和细胞介导的保护性免疫反应。核酸疫苗的兴起和发展为HIV的防治提供了新的途径。核酸疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫反应，特别是诱导细胞免疫反应的能力优于蛋白、多肽类疫苗。
　　 核酸疫苗的免疫效果在不同动物个体中差异较大，某些肿瘤及病毒的T、B细胞表位抗原性弱，难以诱导有效的T、B细胞免疫应答，提高核酸痰苗的免疫效果已成为研究热点。基因佐剂是将编码某些细胞网子及T、B细胞表面共刺激分子等的基因与目的基因克隆于同一载体或不同载体共同免疫动物，其表达的相应蛋白可起到佐剂的作用，从而大大增强T、B细胞的免疫应答水平。
　　 LIGHT是TNF配体家族的成员，可以共刺激T细胞增殖。HVEM是LIGHT介导T细胞活化的受体，LIGHT通过与HVEM结合发挥共刺激作用，参与T细胞增殖和细胞因子的产生。越来越多的证据表明LIGHT与其受体的相互作用可作为控制细胞免疫应答的潜在目标。
　　 基于Nef在HIV感染中的罩要作用，以nef作为靶基因制备HIV核酸疫苗，并研究其免疫效果具有重要意义。本研究利用基因重组技术构建含有nef基因的高效原核表达载体pET24-Nef,并在大肠杆菌BL21中表达高效HIV-1Nef蛋白；利用Nef蛋白免疫家兔，得到高效价兔抗HIV-1nef血清；将全长nef基因插入pcDNA3.1(+)载体巾构建真核表达质粒pcDNA-Nef,体外转染检测结果表明真核表达质粒中的nef基因可在哺乳动物细胞中进行表达；将nef核酸疫苗质粒单独或与LIGHT真核表达质粒联合免疫Balb/c小鼠，细胞免疫与体液免疫功能检测结果表明nef核酸疫苗可以诱导小鼠产生特异性免疫应答，LIGHT与nef核酸疫苗的联合免疫叮诱导小鼠产生更强的免疫反应，证明其发挥了免疫佐剂的作用。