Ⅰ顺铂-聚谷氨酸复合物药物修饰系统的建立及应用Ⅱ基于RCAS-TVA系统的小鼠乳腺癌发病模型的建立及应用

摘要

恶性肿瘤严重威胁着人类的健康和生命，对于肿瘤发病机制及抗肿瘤药物的开发已经投入了大量的人力、财力和物力。顺铂(cisplatin，CDDP)是目前临床上化疗的首选药物之一，具有抗癌活性谱广，杀伤作用强等优点，然而研究表明：铂类抗肿瘤药物属周期非特异性药物，半衰期长，溶解度低，细胞毒性大，无靶向性，大大限制了其在临床上长期和高剂量的使用。因此，研究和开发低毒高效的顺铂类似物，一直是药物修饰领域的研究热点。
　　 随着材料科学技术的发展和应用，高分子聚合物作为药物载体的研究越来越多，基于肿瘤组织内部特有的高通透性和滞留效应(EPR效应)，高分子药物载体通过与药物的相互作用，可以提高药物水溶性，改善药物的药代动力学特性，调控药物在组织中的分布，靶向给药，降低药物的毒副作用或药源性疾病等，对于提高药物的安全性和稳定性具有很高的应用价值。枯草芽孢杆菌发酵来源的γ型聚谷氨酸(γ-PGA)就是一种良好的药物载体，它具有结构单一、制备工艺简单、良好的生物相容性和生物可降解性、良好的缓释和控释性能等优点，近年来，以γ-PGA作为载体的研究备受关注。
　　 基于以上研究背景，为开发一种半衰期长、毒性低、具被动靶向和缓释效果的顺铂类似物，我们将顺铂巧妙地连接到生物发酵合成的γ-聚谷氨酸药物载体上，制备顺铂-聚谷氨酸复合物(γ-PGA-CDDP)，在实验室原有研究基础上，进一步研究该复合物的性质；将其与临床常用化疗药物进行比较；并制备γ-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物(Glutamine Aspartate Polymers，GAP460)以提高药物载量。具体研究内容和结果分为以下两个方面：
　　 (1)枯草芽孢杆菌发酵制备γ-PGA，通过优化反应条件，制备γ-PGA-CDDP复合物，并借助红外吸收光谱和核磁共振的方法对复合物进行表征鉴定。为系统研究γ-PGA-CDDP复合物的性质和生物学活性，将该复合物与临床常用化疗药物顺铂、卡铂和奥沙利铂进行比较：以Bcap-37、BEL-7404和SH-SY5Y三株人源肿瘤细胞为例比较四种药物的细胞毒性和半抑制浓度(IC50)；模拟药物体外释放曲线；以正常昆明小鼠和BALB/cA荷瘤小鼠为动物模型，比较药物作用后的抑瘤效果、体重变化、存活率；白细胞(WBC)、血小板(Platelet，BP)等血液生化指标；肌酐(CRE，CREAP)、尿素氮(BUN，UREA)、髓质过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等肾脏毒性指标，结果证明：γ-PGA-CDDP复合物在细胞水平上不仅可以显著抑制Bcap-37等三株肿瘤细胞的增殖，而且大大降低了细胞毒性，表现为IC50值明显高于顺铂，与奥沙利铂相当，略低于卡铂；在BALB/cA荷瘤模型动物体内，γ-PGA-CDDP复合物可以有效抑制体内肿瘤的生长，相同实验条件下，其抑制作用效果与顺铂相当，优于卡铂和奥沙利铂，同时药物的毒副作用大大降低；在昆明小鼠体内，γ-PGA-CDDP复合物对于动物的损伤最小，顺铂等化疗药物作用后，均可不同程度的引起体内WBC和Platelet数目下降、CRE和BUN含量升高、MPO和MDA上调、GSH和GSH-Px下调，而γ-PGA-CDDP复合物作用后，动物体内各生化指标均保持稳定，肾组织氧化性损伤显著改善，在与临床化疗药物的比较中体现出明显的优势。
　　 (2)γ-PGA的药物载量偏低，高剂量药物治疗时载体用量较大，另外，γ-PGA在体内的代谢过程可能导致神经递质前体的累积，本实验室研究发现，γ-PGA-CDDP复合物的载药量只有14.6％。为解决上述问题，通过酰胺化反应，制备GAP460复合物药物载体，并以顺铂为例，研究顺铂-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物(PACC)的性质和功能，结果证明：GAP460复合物药物载体在37℃、pH6.0-7.4的环境下保持稳定，温度的升高、偏酸或偏碱的环境均可使GAP60复合物发生不同程度的降解；急性毒性实验，单次静脉注射GAP460复合物4.0g/kg动物存活率为100％，单次静脉给予2.0g/kg，动物的体重，体内白细胞(WBC)、血小板(BP)，血清谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、肌酐(CREAP)和尿素氮(UREA)的含量均保持稳定，药物载体安全无毒；相同实验条件下，GAP460复合物的药物载量为38.52％，约为γ-PGA药物载体的3倍，药物载量的提高可大大减少载体的用量，并改善药物的控释效果；PACC复合物不仅在体外可以显著抑制Bcap-37等肿瘤细胞的增殖，IC50值明显高于游离顺铂，而且可以有效抑制BALB/cA荷瘤裸鼠体内肿瘤的生长；同时，PACC复合物大大降低了体内毒副作用，用药后动物体重无明显下降，肾脏功能和肾脏氧化性损伤得到明显改善。
　　 综上所述，本文将γ-PGA-CDDP复合物与临床常用化疗药物开展系统比较研究，并引入天冬氨酸分子对聚谷氨酸药物载体进行了改造，为高分子药物载体和γ-PGA-CDDP复合物的临床应用提供了有益的探索。