蓖麻毒素A链及其突变体的表达、纯化和分析

摘要

蓖麻毒素(ricintoxin，RT)为一种植物来源的、毒性强的蛋白质毒素，其全毒素是由A、B两条多肽链(RTA、RTB)和连接两链的二硫键组成的异二聚体，分子量在62000～66000Da之间。由于毒性强、易于获得和可气溶胶化等特点，RT已成为重要的生物战剂和生物毒素恐怖剂之一。 本实验首先根据RTA链中已明确的关键性氨基酸残基位点，设计了三个突变体RTA(mRTA)旨在降低RTA的毒性和消除RTA链易发生血管渗漏综合征弊端，即mRTAD75AV76MY80A、mRTAD75AV76MY123A和mRTAD75AV76ME177D(以下简称mRTAY80A，mRTAY123A，mRTAE177D)。经Lasergene软件包中Protean程序分析和预测，它们的氨基酸亲水性、抗原指数和表面可及性预测图谱与非突变体(RTA)蛋白的预测图谱基本一致，说明mRTAY80A、mRTAY123A和mRTAE177D三个mRTA的抗原性未发生变化。 然后以含RTA基因的pUC19-RTA为模板，通过PCR方法扩增出RTA基因，又通过定点突变技术获得三种mRTA基因，即mRTAY80A，mRTAY123A，mRTAE177D。上述基因分别连接至pMD18-T载体进行序列分析鉴定，结果表明，PCR扩增的RTA基因序列与GenBank中所报道的RTA基因序列完全一致；三个mRTA基因也按照预先设计要求发生了相应的突变。然后以EcoRⅠ和NheⅠ对pMD18-TRTA、pMD18-TmRTAY80A、pMD18-TmRTAY123A、pMD18-TmRTAE177D和原核表达载体pET-His进行双酶切，按常规方法进行连接，获得四个重组表达质粒pET-HisRTA、pET-HismRTAY80A，pET-HismRTAY123A，pET-HismRTAE177D。经过双酶切和PCR鉴定正确后，分别转化到E.coliBL21(DE3)plysS感受态细胞中，构建了4个相应的表达工程菌。分别在30℃、37℃，经0.4mMIPTG诱导培养2～4h后，4个表达工程菌的SDS-PAGE分析显示，均有一条相对分子量约32kDa的表达蛋白区带，与RTA相对分子量相符。其中，重组RTA(rRTA)蛋白呈现可溶性表达和包涵体表达两种形式，且rRTA蛋白可溶性的表达量约占全菌蛋白的18.45％；其余三个mRTA蛋白均为包涵体形式，目的蛋白表达量依次为17.21％、26.22％、32.79％。 根据重组蛋白N端带有6×His标签的特征，用螯合镍离子次氨基三乙酸(Ni-NTA)的亲和层析柱对重组蛋白进行一步纯化。其中，在非变性条件下rRTA经咪唑浓度梯度洗脱，目的蛋白在含100mM咪唑的洗脱液中被洗脱下来，经TotalLab2.0图像软件分析纯化蛋白的纯度达97.53％左右，1L工程菌培养液可纯化到约18mg的rRTA蛋白；在变性条件下，三种mRTA蛋白经pH梯度洗脱，结果目的蛋白在pH4.0的洗脱液中被洗脱下来，三种mRTA蛋白的纯度在76.2％～89.5％之间，1L工程菌培养液可纯化到的mRTA蛋白约在42.75mg～50.59mg之间。经Western印迹分析，rRTA蛋白和三种重组mRTA蛋白均可被鼠抗天然蓖麻毒素多克隆抗体识别，说明表达和纯化的目的蛋白是正确的，并均具有良好的抗原性。这为以三种mRTA蛋白为基础进行RT疫苗的研制奠定了必要的基础。 此外，用rRTA蛋白免疫昆明小鼠，经两次加强免疫后，免疫鼠血清的ELISA效价达到1×10-6以上，并且在体外中和试验中，该血清具有中和天然RT的作用，表明rRTA能引起小鼠正常的免疫应答，可以作为一种良好的免疫原。同时，还以纯化rRTA蛋白为抗原，免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤技术成功筛选到4株能稳定分泌抗rRTA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，即1B9、4B9、6H10、2E8。经初步鉴定4株杂交瘤细胞株所制备的腹水单克隆抗体，均能特异性识别天然RT，与大肠杆菌菌体蛋白粗制液和金葡菌肠毒素B(SEB)没有交叉反应，表明其具有良好的特异性，为今后发展RT的诊断抗体奠定了基础。

目录

论文说明：缩略词表

引言

实验一重组蓖麻毒素A链的可溶性表达、纯化和抗体制备

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

实验二重组蓖麻毒素A链突变体的设计、表达纯化和分析

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

结论

参考文献

蓖麻毒素的研究进展

重组蓖麻毒麻A链蛋白的可溶性表达、纯化与抗原性分析

致谢