靶向细菌16S rRNA核酸抗菌素的初步研究

摘要

目的：反义技术的发展为研发新一代抗菌药物提供了新思路。本研究以大肠杆菌16SrRNA为药物作用靶标，运用本实验室建立的MAST技术平台筛选其反义核酸作用靶点；通过体外和胞内实验对筛选靶点的有效性进行验证，以期获得能高效结合反义寡核苷酸的靶点序列；根据有效作用靶点合成硫代反义寡核苷酸研究其抑菌效果，为研发新一代核酸抗菌药物进行有益探索。 方法：通过在转录16SrRNA过程中引入生物素标记的UTP，将其固定到亲和素磁珠上，保持RNA的自然折叠状态。然后与寡核苷酸文库杂交，筛选能结合的文库序列从而阐明靶点，该方法即为MAST技术(mRNAaccessiblesitetagging)。运用该技术筛选获得16SrRNA6个反义寡核苷酸结合靶点。根据靶点，设计并合成6条靶点特异的反义寡核苷酸和5条10-23型脱氧核酶(DNAenzyme)。采用反义寡核苷酸依赖RNaseH切割技术对6条反义寡核苷酸体外对16SrRNA的结合能力进行检测，并采用10-23型脱氧核酶催化切割技术对其中5条脱氧核酶的体外结合切割活性进行检测。经体外验证，所筛6个靶点中5个靶点为16SrRNA可及位点，其中靶点Ⅴ(907-926nt)结合活性最好。然后，构建原核表达载体用IPTG诱导表达单倍体锤头状核酶(sRZ)和双倍体锤头状核酶(dRZ)，利用表达的核酶胞内特异降解16SrRNA抑制大肠杆菌生长，对靶点Ⅴ胞内有效性进行验证。针对体外和胞内验证有高效结合活性的靶点Ⅴ，合成硫代反义寡核苷酸与通透性好的大肠杆菌SM101温育，检测其对大肠杆菌生长的抑制效果，进行核酸抗菌素的初步研究。 结果：运用MAST技术筛选获得位于16SrRNA179-198、446-465、497-516、887-906、907-926、1236-1255nt6个靶点(Ⅰ-Ⅵ)；反义寡核苷酸依赖RNaseH切割活性分析结果显示，靶点Ⅱ-Ⅵ为反义寡核苷酸体外高效结合靶点；脱氧核酶催化切割活性分析结果显示，靶点Ⅴ体外活性最为显著；胞内验证结果表明，针对靶点Ⅴ的单倍体和双倍体核酶对大肠杆菌生长均有抑制效果，且双倍体核酶效果更为显著；针对靶点Ⅴ的硫代反义寡核苷酸在80μM浓度下对大肠杆菌生长有显著抑制效果。 结论：MAST技术筛选获得的16SrRNA6个靶点中5个靶点体外为反义核酸高效结合靶点；靶点Ⅴ体外活性最为显著，10-23型脱氧核酶可以作为MAST技术体外进一步优选高效结合靶点的方法；选择进行验证的靶点Ⅴ胞内也为活性靶点，载体胞内表达核酶可以作为靶点胞内活性验证的有效方法；针对MAST技术筛选的活性靶点，设计合成的硫代反义寡核苷酸对大肠杆菌生长有抑制效果，为进一步研发核酸抗菌素奠定了基础。同时，双倍体核酶比单倍体核酶对大肠杆菌生长有更显著的抑制效果，对设计高效核酶具有重要指导意义。

目录

缩略词表

摘要

前言

第一部分MAST技术和16S rRNA靶点的筛选

摘要

前言

1实验材料

2实验方法

2.1 16S rRNA基因的获得及确认

2.2体外转录生成生物素标记16S rRNA

2.3寡核苷酸文库的设计与合成

2.4 rRNA的固定

2.5分子杂交获得与16S rRNA结合的寡核苷酸序列

2.6靶点的阐明

3实验结果

4讨论

5总结

第二部分靶点有效性的体外验证

摘要

前言

1实验材料

2实验方法

2.1反义寡核苷酸和DNAenzyme的设计和合成

2.2采用反义寡核苷酸依赖RNase H体外切割活性分析

2.3采用DNAenzyme体外切割活性分析

3实验结果

4讨论

5总结

第三部分靶点有效性的细胞内验证

摘要

前言

1实验材料

2实验方法

2.1 pET-28a(+)载体的改建

2.3 pET-28a(+)-EcoR Ⅰ-16SdRz和pET-28a(+)-EcoR Ⅰ-16SsRz重组质粒的获得

2.4 1 6SdRz和1 6SsRz对大肠杆菌生长的抑制

3实验结果

4讨论

5总结

第四部分反义寡核苷酸对细菌生长的抑制

摘要

前言

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2实验结果

3讨论

4总结

结论

参考文献

致谢

综述反义寡核苷酸递送方法研究进展

附录

生成随机反义寡核苷酸序列的SAS程序和结果

在读期间发表的论文和综述