低氧对神经干细胞增殖和分化的影响及HIF-1的作用机制

摘要

神经干细胞(NSC)是具有高度自我更新能力和多项分化潜能的神经前体细胞。它能最终分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，因此对治疗神经退行性疾病和损伤有着广阔的应用前景，目前已成为神经系统领域的研究热点。而氧是生命存在的必要条件，也是细胞生理功能的一种重要调节因子，氧浓度的变化可影响细胞的功能状态。目前关于低氧作用的研究多集中在低氧对细胞的损伤和有关的适应机制方面，而关于低氧在细胞增殖和分化中的作用研究较少，特别是关于低氧对NSCs增殖和分化的影响目前还不太清楚。低氧诱导因子一l(HIF—1)是细胞低氧反应的核心调控因子，诸多研究表明它在肿瘤细胞增殖中起着重要的调控作用，但关于它是否参与低氧对NSCs增殖和分化的影响国内外未见报道。因此本研究利用各种细胞分子生物学手段，比较了不同氧浓度对NSCs增殖和分化的影响，观察了低氧后NSCs内HIF-la的表达变化，并探讨HIF一1α在低氧引起的NSCs增殖和分化中的作用。 一、神经干细胞分离、培养和鉴定以及低氧浓度测定 Wistar孕大鼠(E13．5d)戊巴比妥钠麻醉后，无菌条件下取出胎鼠，分离胎鼠中脑NSCs。传3代后，制成单细胞悬液，在涂有多聚赖氨酸(0．1mg／m1)的confocal皿中贴壁半小时，4％多聚甲醛固定后，用免疫组化进行Nestin鉴定，鉴定结果表明几乎所有细胞均为Nestin染色阳性，说明培养的NSCs较纯，可用于下面的实验。 把通过以上方法得到的NSCs分别置于不同环境氧浓度中(20％02，10％02，3％O2，0％O2)，培养3d后，分别用血气分析仪和自动生化分析仪测定细胞培养上清中的氧分压和乳酸浓度。氧分压依次为153±7、105±5、80±10和65±15mmHg；乳酸浓度依次为O．875±0．251、L425±0．¨2、1．825±0．220和2．096±O．233mmol几。由以上结果可以看出，随着环境氧浓度的下降，细胞培养上清中的氧分压随之下降，而乳酸浓度随之增高，在环境氧浓度为O％02时，细胞培养上清的乳酸浓度达2．096mmol／L。乳酸浓度过高不利于细胞生长，因此在以下的实验中，采用10％和3％氧浓度来观察低氧对NSCs增殖和分化的影响。 二、低氧对神经干细胞增殖的影响及HIF-1的作用 细胞分组后分别置于常氧(20％02)和低氧(10％O2，3％02)环境中，培养3d后，采用神经球记数、Brdu掺入和流式细胞术(测定增殖指数)等方法观察NSCs的增殖情况。神经球记数结果表明：10％和3％的氧浓度可明显促进神经球的形成，其增殖的神经球数目分别为常氧组的2．5和1．5倍；BrdU掺入结果表明，在低氧环境中BrdU标记的阳性细胞数目明显高于对照组；增殖指数结果表明，10％低氧组明显高于对照组，而3％低氧组低氧早期增殖被抑制，经过一段时间的适应后，增殖指数有所增加，但仍不如10％低氧组明显。 鉴于10％低氧促NSCs增殖作用更为明显，因此我们观察了10％低氧条件下NSCs内HIF-1α的表达变化。RT-PCR结果表明：从低氧6h开始，HIF-1αmRNA水平比对照组明显增加；Westernblot分析结果表明：常氧条件下，几乎检测不到HIF-i~蛋白的表达，而低氧组在低氧6-72h内都可以检测到HIF-1α蛋白的表达。以上结果提示，HIF-1可能在低氧促NSCs增殖中起着重要的调控作用。 为了进一步证明HIF-1在低氧促NSCs增殖中的作用，用携带HIF-1α基因的Ad5腺病毒载体和针对HIF-I~mRNA的pSilencerTMU6／Neo／GFP／RNAi质粒载体分别过表达和抑表达HIF-1α，并观察其对常氧或低氧条件下NSCs增殖的影响。增殖指数和细胞记数的结果表明：HIF一1α过表达可促进常氧或低氧条件下NSCs的增殖；而抑制HIF一1α的表达可阻断低氧条件下NSCs的增殖。由以上结果得出结论：HIF-1参与了低氧促NSCs增殖的调控；且HIF-1具有不依赖低氧的促NSCs增殖的作用。 三、低氧对神经干细胞分化的影响及HIF-1的作用 取第三代神经干细胞，分别置于常氧(20％02)和低氧(10％02，3％02)条件下，在诱导液中培养3d后，各组记数种于涂胶皿并改用分化液，分化成熟5-7天后，用免疫组化、FACS和HPLC检测NSCs的分化方向。组化和FACS结果表明，在低氧环境中培养的神经干细胞与常氧组相比可分化为更多的神经元和较少的神经胶质细胞，从神经元类型上看低氧可促进神经干细胞向TH阳性神经元方向分化，且以3％低氧条件下更为明显；HPLC检测培养上清中DA浓度的结果表明，10％低氧组与对照组无明显差异，3％低氧组细胞培养上清中DA的浓度比对照组明显增加以上结果表明，低氧(3％)促进NSCs向多巴胺能神经元方向分化。 TH是转录因子HIF-1的靶基因，又是多巴胺合成过程中关键的限速酶，因此为了探讨低氧(3％)促进NSCs向多巴胺能神经元方向分化的机制，观察了3％低氧条件下NSCs内HIF-I~的表达变化。RT-PCR结果表明：在低氧过程中，HIF一1αmRNA表达水平无明显变化；Westernblot分析结果表明：常氧条件下，几乎检测不到HIF-i~蛋白的表达，而低氧组在低氧3—72h内都可以检测到HIF-la蛋白的表达。以上结果提示，HIF-1可能在低氧(3％)促进NSCs向多巴胺能神经元方向分化中起着重要的调控作用。 为了进一步证明HIF-1在低氧促NSCs向多巴胺能神经元方向分化中的作用，用携带HIF一1α基因的Ad5腺病毒载体过表达HIF-1α，观察其对常氧或低氧条件下NSCs分化方向的影响。FACS和HPLC检测结果表明：HIF-1α过表达可促进常氧或低氧条件下NSCs向多巴胺能神经元方向分化。由以上结果得出结论：HIF-1参与了低氧条件下NSCs向多巴胺能神经元方向的分化；且在常氧条件下HIF-1即可通过上调TH的表达来促进NSCs向多巴胺能神经元方向的分化。 综上所述，低氧对NSCs的增殖和分化均有影响，且NSCs对不同低氧浓度的反应是不一样的。就增殖而言，10％O2促进了NSCs的增殖，且HIF-1参与了其促NSCs增殖的调控；就分化而言，3％02促进NSCs向神经元方向特别是向多巴胺能神经元方向的分化，HIF-1可能通过上调其靶基因TH的表达从而参与NSCs向多巴胺能神经元方向的分化。因此，本课题在目前人们越来越重视干细胞研究的情况下，对干细胞增殖分化调控机制的阐明有着重要的理论意义，同时也为用物理因素人工调节干细胞的增殖和分化提供了新的思路。

目录

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英文缩写词表

摘要

前言

第一部分神经干细胞分离、培养和鉴定以及低氧浓度测定

第二部分低氧对神经干细胞增殖的影响及HIF-1的作用

第三部分低氧对神经干细胞分化的影响及HIF-1的作用

总结

参考文献

神经干细胞增殖分化的影响因素、调控机制与应用

低氧对胎鼠中脑NSCs的促增殖作用

Potential role of HIF-1 in NSC proliferation induced by hypoxia

博士期间发表和待发表的文章、学术会议及基金申请

致谢