乙肝表面抗原在烟草和烟草悬浮细胞系中的表达

摘要

该研究的主要目的是建立乙肝表面抗原基因（S基因）在烟草及烟草悬浮细胞系中稳定表达的转化体系.首先将S基因克隆入一个植物基因工程表达载体pCAMBIA1301.这个载体不但具有可插入植物基因组的T-DNA区以及抗生素筛选基因,而且带有快速鉴别转化株的报告基因GUS.表达载体被转化入农杆菌LBA4404以后,用农杆菌侵染的方法去转化烟草和烟草悬浮细胞系BY-2（Bright Yellow-2）.通过对转化株的鉴定,方法包括PCR、GUS染色、酶连免疫分析（ELISA）和WESTERN BLOT等,证明烟草和烟草细胞系能够成功表达乙肝表面抗原.同时我们对转化株粗提蛋白进行了硫酸铵分级沉淀,ELISA分析表明S抗原在40﹪～50﹪的硫酸铵浓度范围内沉淀最多.对T1代转化烟草的初步遗传分析提示,S基因有可能为单拷贝插入.我们还对转化的BY2细胞进行了显微镜下观察,发现S基因的转入并没有影响BY2细胞的生长周期长短及外观形态.在该课题的基础上,进一步的研究将着重于植物源性病毒抗原的免疫原性及其人体免疫系统的相互作用.从这方面来讲,由于烟草悬浮细胞系生长周期短、成本低,因此在基础研究方面有着烟草植株所无法比拟的优势.

目录

ABSTRACT

前 言

参考文献

第一部分构建乙肝表面抗原基因烟草表达载体

1.1引言

1.2材料与方法

1.2.1材料

1.2.2方法

1.3结果

1.3.1pHBT-S的构建

1.3.2pHB163-S质粒的构建

1.3.3pHB1301-S的构建

1.4讨论

1.4.1目的基因的克隆

1.4.2植物特异启动子

1.4.3 T-DNA区

1.4.4报告基因GUS

1.4.5抗生素筛选标记

参考文献

第二部分叶盘法转化烟草

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1材料

2.2.2方法

2.3结果

2.3.1重组质料pHB1301S转化农杆菌LBA4404

2.3.2叶盘法转化烟草

2.3.3烟草转化株的PCR鉴定(图-2-4)

2.3.4烟草转化株的GUS染色鉴定(图-2-5)

2.3.5烟草转化株的ELISA鉴定(表-1)

2.3.6 烟草转化株粗提蛋白的SDS-PAGE电泳和WESTERNBLOT

2.3.7T1代烟草的初步遗传分析

2.3.8 烟草源性乙肝表面抗原蛋白的硫酸铵沉淀分析

2.4讨论

参考文献

第三部分BY2细胞的转化

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1材料

3.2.2方法

3.3结果

3.3.1野生型烟草细胞BY2的形态观察

3.3.2烟草细胞BY-2的转化

3.3.3 烟草细胞BY-2的镜下观察

3.3.4转化细胞株的GUS染色

3.3.5转化细胞株基因组DNA的PCR鉴定(图-3-4)

3.3.6转化细胞株粗提蛋白的ELISA(表-3)

3.4讨论

参考文献

第四部分综述：传染病植物疫苗研究的现状

植物疫苗的巨大潜力

植物口服疫苗的免疫学基础

免疫源性蛋白在植物中表达的方法

目前的研究动态

1.乙型肝炎疫苗

2.感染性腹泻疫苗

3.狂犬病及其他传染病疫苗

4.动物传染病疫苗

植物疫苗研究中存在的问题

1.优化重组基因，提高表达

2.植物疫苗稳定性的问题

3.口服耐受的问题

4.选择合适的植物种类

参考文献

致谢

在校期间论文发表情况