捕获包被ELISA方法检测血小板抗体的可行性研究

摘要

研究目的： 血小板抗体检测在疾病的诊断和疗效的判断方面非常重要，至今还没有一种真正具有临床实用价值的血清学检测方法，现有的技术和方法所得的结果差异较大，分子生物学的方法不适合临床常规应用，而血清学方法从实验原理分析，多采用从富血小板血浆中提取血小板来包被反应板，进一步用直接法或间接法检测相应抗体。这些技术只能检测血小板表面是否粘附Ig或血清中是否含有可致敏血小板的Ig，不能确定该抗体是血小板特异性抗体，而且存在一些缺点：如特异性和/或灵敏度较低、操作繁琐、时间长、需血量大、成本高等。因此，有必要从检测技术上提高血小板抗体检测的可靠性，建立一套灵敏、准确、实用、可行的酶联免疫测定方法，对于研究手段的完善及其临床应用将具有实际的意义。本研究旨在建立捕获包被ELISA方法检测血小板抗体，同时可筛选相和的供者，以解决现有检测方法的不足，为临床输血服务。 研究方法与结果： 1．血小板膜蛋白复合物(POMPC)的提取及其免疫原性测定以混合O型献血者血小板为实验对象，比较SDS破碎法、DTT裂解法、NP-40裂解法和Triton X-100裂解法四种方法，经SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色以及Westernblotting测定，其主要含有分子量从50kDa到160kDa的几乎所有血小板膜糖蛋白和少量小分子的蛋白，Triton X-100法裂解血小板POMPC溶解性好、免疫原性强，具有广泛的抗原交叉反应性，而前三种方法裂解的不完全。用ELISA测定此POMPC与兔抗人血小板多抗血清反应的效价为102400。 2．兔抗人血小板多克隆抗体的制备与纯化取TritonX-100裂解法制备的POMPC，用PH7.4的PBS调整裂解上清的蛋白浓度为0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml各1.5ml，与福氏完全佐剂充分乳化后免疫日本大耳白兔，经过基础免疫、加强免疫后行心脏穿刺抽血，分离血清。采用33％饱和硫酸铵粗提纯和蛋白G柱亲和层析两步进行抗体纯化。 3．捕获包被ELISA法的建立及效果评价用纯化的兔抗人血小板多克隆抗血清包被酶联板，以磷酸氯奎处理前后的混合0型血小板POMPC或单一献血者血小板作为捕获抗原，用HRP酶标记物建立了捕获包被法。应用结果显示，方法具有极好的特异性和稳定性，180份阴性血清无一例假阳性；临床124份SEPSA法检测阴性的标本中，有13份标本捕获包被法检测阳性，这13份标本经流式细胞仪确证试验均为阳性。 结论： 目前临床普遍采用SEPSA和微柱凝胶的方法进行血小板抗体筛选，这些技术是检测血小板表面是否粘附Ig或血清中是否含有可致敏血小板的Ig，不能确定该抗体是血小板特异性抗体，本文采用纯化多抗血清包被建立捕获包被ELISA方法，可同时检测PAIg和PBIg，并同步筛选相合的献血者，大大提高了检测的特异性和可操作性，避免了非特异反应的发生；同时由于兼顾了血小板抗体不同型别的差异，也使检出率有所提高。多克隆抗体的包被克服了单抗价格昂贵以及应用时难以掌握不同人群血小板膜抗原的差别影响等难题，提高了检出率，应用HRP标记这一成熟稳定的信号放大系统提高了方法灵敏度。如用于献血者筛选，可以缩短检测时间，使患者得到及时救治；并有可能代替昂贵复杂的磁珠介导的流式细胞仪血小板分析方法，成为简便易行的血小板抗体确证试验。

目录

论文说明：缩略语

声明

摘要

引言

第一部分兔抗人血小板多克隆抗体的制备与纯化

材料与方法

结果

小结

第二部分捕获包被ELISA方法的建立及条件优化

材料与方法

结果与讨论

小结

第三部分：捕获包被ELISA方法的临床应用及方法学评价

材料与方法

结果

讨论

总结

参考文献

在学期间发表的论著

致谢

个人简历