SPK-S1P信号调节多发性骨髓瘤细胞凋亡的作用及机理研究

摘要

多发性骨髓瘤(multiplemyeloma，MM)是一种源于晚期B细胞的恶性肿瘤，其特征为骨髓中单克隆浆细胞无限增生及血清或尿中出现单克隆的免疫球蛋白。由于该病的发病机理还不十分清楚，目前一直缺乏根治的有效手段。因此，深入多发性骨髓瘤的发病机理研究对其诊断和治疗将具有重要的意义。 多发性骨髓瘤细胞的增殖及凋亡受细胞因子及骨髓微环境的调节。骨髓瘤细胞本身以及骨髓微环境可以分泌多种细胞因子，尤以IL-6的过度产生与MM的关系最为密切。这些细胞因子通过自分泌或旁分泌的方式对多发性骨髓瘤细胞的增殖、凋亡以及耐药特性发生影响，这其中涉及到多种信号途径，包括JAK-Stat、PI-3K、MAPK、Rho、FAK等。除此之外，是否还有其它的信号转导途径参与?近几年研究证明细胞膜鞘磷脂的衍生物包括Cer、Sp、S1P等多种代谢产物，在调节细胞增殖和凋亡的动态平衡中起着极为关键的作用。而磷酸鞘氨醇激酶(sphingosinekinase，SPK)是维持细胞内上述物质平衡的重要限速酶，也是细胞增殖及存活的重要调控因子。但是，SPK-S1P信号在多发性骨髓瘤发病中的作用并不清楚。本研究检测了SPK-S1P信号途径相关分子在骨髓瘤细胞的表达情况；发现S1P通过上调mcl-1，进而抑制MM细胞的凋亡，并进一步证明了SPK-S1P信号介导IL-6抑制骨髓瘤细胞凋亡的生物学作用。 为了检测SPK-S1P信号通路相关分子在MM细胞的表达。我们利用免疫磁性分离的方法分离了MM病人骨髓中CD138阳性骨髓瘤细胞，利用RT-PCR和NorthernBlot的方法分别检测了原代骨髓瘤细胞以及骨髓瘤细胞系中SPK及S1P受体的表达情况。研究结果表明MM原代细胞和细胞系U266、XG-7、SKO-007等都表达SPK及S1P受体EDG1、EDG3、EDG5，这提示多发性骨髓瘤细胞可能受到SPK-S1P信号的调控。为确定S1P对骨髓瘤细胞凋亡的影响，我们利用地塞米松诱导的骨髓瘤细胞系XG-7细胞的凋亡，加入外源S1P能够抑制XG-7细胞凋亡。进一步研究发现外源S1P可以上调XG-7细胞Mcl-1的表达，当用S1P受体阻断剂PTX处理XG-7细胞后，S1P对Mcl-1的上调作用受到抑制。可以得出如下结论：外源S1P可能通过上调Mcl-1的表达来抑制XG-7细胞的凋亡。细胞内S1P是由SPK催化产生，而SPK的活性受多种细胞信号的调节。为探3讨SPK-S1P和IL-6信号在骨髓瘤细胞中的作用及关系，我们建立了用γ-32P掺入方法测定SPK活性的方法。利用不同浓度的IL-6刺激原代骨髓瘤细胞及细胞系，然后测定细胞内SPK的活性。发现IL-6能够提高MM细胞内SPK活性，并且具有量效关系。为确定IL-6激活SPK的信号途径。我们利用PI-3K、MAPK、Rho和JAK-STAT信号通路的特异性阻断剂LY294002、PD98059、Y27632和AG490阻断上述通路后，再测定IL-6对SPK的激活作用。发现LY294002、PD98059和AG490可以明显阻断IL-6对SPK的激活作用，表明MAPK、PI-3K和JAK-STAT等多条信号通路参与IL-6对SPK的激活作用。 为了确定SPK-S1P信号激活对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响，我们构建了携带SPK的逆转录病毒表达载体pLXSN-SPKwt，用脂质体转染的方法将该载体导入包装细胞GP+E-86，收获瞬时逆转录病毒上清再感染包装细胞PA317，经过G418筛选获得能够产病毒的包装细胞系。扩增并收集逆转录病毒上清，逆转录病毒的滴度大于5×105CFU/ml。利用该逆转录病毒感染多发性骨髓瘤细胞U266和XG-7，经过G418筛选获得高表达SPK的多发性骨髓瘤细胞系。通过WesternBlot确定了外源性SPK在上述细胞中的表达，从而建立了激活SPK的多发性骨髓瘤细胞系。高表达SPK的多发性骨髓瘤细胞对地塞米松诱导的细胞凋亡较对照细胞明显减低，证明了激活SPK能够抑制DEX诱导的多发性骨髓瘤细胞凋亡。我们利用RNA干涉策略阻断骨髓瘤细胞SPK的表达，进而降低细胞内该酶的活性。观察到抑制SPK的活性促进多发性骨髓瘤细胞的凋亡。从而确证了SPK激活对骨髓瘤细胞凋亡的抑制作用。 IL-6对骨髓瘤细胞凋亡的抑制作用主要通过上调mcl-1分子。我们进一步观察了SPK激酶在IL-6上调mcl-1表达过程中作用。，我们利用高表达SPK的细胞模型以及通过RNA干涉阻断SPK的细胞模型，从正反两个方面确证了SPK与Mcl-1表达的关系。我们发现XG-7/SPKwt细胞其Mcl-1表达水平较对照XG-7/Plxsn细胞高；当阻断SPK后，细胞Mcl-1的表达降低，而IL-6对Mcl-1的上调作用也受到抑制。这些结果表明SPK通过上调Mcl-1来发挥其抗凋亡的作用。 综上所述，我们鉴定了SPK-S1P相关信号分子在多发性骨髓瘤细胞上的表达；证明了高表达SPK可抑制多发性骨髓瘤细胞的凋亡。IL-6可以通过MAPK、PI-3K、JAK-Stat信号通路激活SPK-S1P信号，并进一步通过上调mcl-1调节骨髓瘤细胞凋亡。本研究确定了SPK-S1P信号在多发性骨髓瘤细胞凋亡调节过程中的作用，为多发性骨髓瘤的治疗提供了新的靶点。

目录

英文缩略词对照表

课题思路及技术路线

前 言

第一部分：SPK-S1P信号抑制多发性骨髓瘤细胞凋亡

1.材料

2.方法

3.结果

4.小结

第二部分：IL-6激活MM细胞SPK-S1P号

1.材料

2.方法

3.结果

4.小结

第三部分：SPK介导IL-6信号抑制MM细胞的凋亡

1.材料

2.方法

3.结果

3.1逆转录病毒载体pLXSN-SOKWT的构建

3.3利用制备的pLXSN、PLXSN-hSkwt、逆转录病毒感染MM细胞

3.4Western blot、SPK酶活性检测转染hSkwt基因的表达

3.4FITC标记的阴性对照siPNA转染MM细胞

3.5SPK1siRNA抑制IL-6对SPK的激活作用

3.6IL-6上调MM细胞Mcl-1的表达

4.小结

讨 论

总 结

参考文献

致谢