β-amyloid寡聚体调节Munc-18表达及其相关效应研究

摘要

该实验对Aβ寡聚体调节Munc-18的变化及其可能的相关效应进行了初步研究.1.为了探讨Aβ寡聚体对Munc-18表达的影响,我们用western blot、流式细胞术和免疫组织化学的方法在培养细胞和动物上进行了初步研究.首先在制备鉴定Aβ1-40寡聚体的基础上,以视黄酸诱导分化的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为对象进行研究.2.由于Munc-18可参与递质释放的调节机制,为了观察Aβ寡聚体引起细胞Munc-18水平改变后是否同时有递质释放的改变,我们用HPLC的方法检测了1nMAβ寡聚体处理后的SH-SY5Y细胞去甲肾上腺素(NE)和肾上腺素(E)的释放.3.用SH-SY5Y细胞转染了外源munc-18基因,然后进行了免疫荧光双标染色,结果显示,过表达Munc-18的细胞内磷酸化Tau蛋白的水平增加.为了研究Aβ寡聚体诱导的Munc-18表达变化是否与Tau磷酸化相关,我们对Aβ寡聚体诱导Munc-18表达变化的细胞,同时进行磷酸化Tau蛋白检测.Western blot结果显示,当处理细胞的Aβ寡聚体浓度是1nM时,AT8抗体检测到的磷酸化Tau蛋白水平变化与Munc-18较一致,而5nMAβ作用后,Munc-18表达抑制,但Tau蛋白磷酸化仍有增加.另外,Aβ寡聚体脑室内注射后western blot检测到大鼠海马内磷酸化Tau蛋白水平增加,也没有与Munc-18表达变化的趋势完全一致.提示Aβ可诱导Tau磷酸化机制,但Munc-18可能只参与其中部分机制.4.最后,我们观察了Aβ寡聚体对β-淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的影响.免疫组织化学和western blot显示Aβ寡聚体(1.6μM×3μl)的作用没有使大鼠海马内总的APP发生显著变化,但是我们观察到Golgi体内的酶切形成的分泌型APP片段减少,突触小体内APP也减少.

目录

引言

材料和方法

1.材料

1.1.细胞株

1.2.实验动物

1.3.试剂及来源

1.4.主要仪器

2.方法

2.1.溶液配制

2.2.Aβ寡聚体的制备

2.3.Aβ寡聚体的鉴定

2.4.SH-SY5Y细胞培养

2.5.SH-SY5Y细胞蛋白样品处理

2.6.MTT分析

2.7.流式细胞术

2.8.细胞膜分离和提取

2.9.Aβ膜提取物结合分析

2.10.SH-SY5Y细胞单胺类递质释放测定

2.11.外源性munc-18基因在培养的SH-SY5Y细胞上的表达

2.12.SH-SY5Y细胞Munc-18和P-Tau免疫双标

2.13.Aβ寡聚体侧脑室注射

2.14.冰冻组织切片制备

2.15.免疫印迹样品制备

2.16.突触小体分离

2.17.Golgi体分离

2.18.考马斯亮蓝法蛋白定量

2.19.Western免疫印迹

2.20.免疫组化染色

2.21.积分光密度分析

2.22.统计分析

实验结果

1.Aβ寡聚体对Munc-18的调节

1.1.SH-SY5Y细胞株表达Munc-18

1.2.Aβ的聚集

1.3.Aβ寡聚体对分化的SH-SY5Y细胞Munc-18的调节作用

1.4.Aβ寡聚体对SH-SY5Y细胞代谢的影响

1.5.Aβ单体和单独Zn2+作用对SH-SY5Y细胞Munc-18的影响

1.6.不同浓度Aβ寡聚体对SH-SY5Y细胞Munc-18蛋白量调节作用比较

1.7.Aβ寡聚体脑室内注射后，大鼠脑内Munc-18的变化

1.8.Aβ和细胞膜提取物的结合反应

2.Aβ寡聚体对SH-SY5Y细胞递质释放的影响

3.Munc-18参与Aβ寡聚体诱导的磷酸化Tau蛋白变化

3.1.寡聚体处理后，SH-SY5Y细胞内磷酸化Tau蛋白的变化

3.2.转染munc-18基因后，SH-SY5Y细胞Munc-18和磷酸化Tau蛋白免疫荧光双标

3.3.Aβ寡聚体脑室内注射后，免疫组织化学方法检测大鼠脑内磷酸化Tau蛋白的变化

3.4.Aβ寡聚体脑室内注射后，westernblot检测大鼠海马Munc-18、P35和磷酸化Tau蛋白的变化

4.Aβ寡聚体对大鼠脑内APP的影响

4.1.Aβ寡聚体脑室内注射后，免疫组织化学染色显示大鼠脑内APP的变化

4.2.Aβ寡聚体脑室内注射后，westernblot检测大鼠脑各亚细胞组分APP变化

讨论

1.Aβ的毒性作用

2.Aβ的聚集

3.Aβ寡聚体对Munc-18的调节

4.Aβ对递质释放的影响和机制

5.Munc-18参与Aβ诱导的Tau蛋白磷酸化机制

6.Aβ对APP的调节

结论

参考文献

综述1 Munc-18调节突触泡融合

综述2 β-淀粉样蛋白免疫治疗阿尔茨海默型痴呆的研究进展

致谢

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